Способ получения эмбриогенной клеточной суспензионной культуры зерновых

(51)7 01 4/00 , 12 5/02 ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(72) Лесова Жаниха Туреевна Жулавчинова Сауле Оразбековна Жардемали Женис Кадырович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Министерства науки и высшего образования Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭМБРИОГЕННОЙ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ЗЕРНОВЫХ(57) Изобретение относится к биотехнологии, клеточной селекции и генной инженерии. Способ получения эмбриогенной суспензионной клеточной культуры зерновых включает введение каллусов в жидкую питательную среду, с последующим культивированием на качалке при 119-121 оборотах в минуту, на свету, при температуре 24-26 С,при этом используют каллусы, полученные из пыльников пшеницы на стадии 2-6-ядерной микропыльцы, которые вводят на обогащенную аминокислотами питательную среду. Способ позволяет увеличить выход клеток меристемоидного типа, сократить сроки получения суспензионной культуры и формирование ее из каллусов и пыльников пшеницы. 10834 Изобретение относится к биотехнологии, клеточной селекции и генной инженерии. Известен способ получения эмбриогенной клеточной суспензионной культуры из незрелых зерновок пшеницы путем введения в жидкую культуру на питательной среде Мурасиге-Скуга 5-8-месячных каллусов компактной структуры с последующим культивированием на качалке при 119-121 оборотах в минуту, на свету, при температуре 24-26 С( ,.,.(..)//, 1990,. 714-717). Недостатком этого способа является малый выход суспензионных клеток (прирост клеток) за два периода субкультивирования, слабая диссоциация клеток, отсутствие в среде набора аминокислот,гормонов роста кинетина и гиббереловой кислоты и длительный срок получения культуры (больше года). Задачей изобретения является разработка способа получения эмбриогенной суспензионной клеточной культуры зерновых, обеспечивающего увеличение выхода клеток меристемоидного типа, сокращение сроков получения суспензионной культуры и формирование ее из каллусов и пыльников пшеницы. Способ получения эмбриогенной суспензионной клеточной культуры зерновых включает введение каллусов в жидкую питательную среду, с последующим культивированием на качалке при 119-121 оборотах в минуту, на свету, при температуре 24-26 С, при этом используют каллусы, полученные из пыльников пшеницы на стадии 2-6-ядерной микропыльцы, которые вводят на обогащенную аминокислотами питательную среду. Способ осуществляют следующим образом. Для внесения в культуру отбираются одномесячные каллусы ярко-желтого цвета гроздьевидной структуры, полученные из пыльников пшеницы. В качестве питательной среды используют среду Мурасиге-Скуга (МСА), обогащенную добавлением аминокислот (приложение), способствующих не только активному росту культуры, но и преимущественному делению клеток меристемного типа, что способствует формированию высокодиспергированной клеточной суспензии. Для получения клеточной суспензии были испытаны следующие питательные среды- Мурасиге-Скуга, обогащенная набором аминокислот (МСА). Наименьший рост культуры наблюдался на базовой среде Мурасиге-Скуга. Модификация среды(Мсмод) заметно стимулировала рост культуры сырая биомасса за 3 суток увеличивалась почти в 1,5 раза. Такой же эффект наблюдался и при использовании питательной среды Гамборга В-5. Наилучшей из испытанных сред оказалась МСА, в которой за период субкультивирования биомасса клеток (прирост) почти удваивалась (таблица). Относительный рост сырой биомассы суспензионной культуры пшеницы в зависимости от состава питательной среды (за один период субкультивирования) Питательные среды Прирост биомассы клеток,от исходного веса Формирование суспензионной культуры состоит из трех этапов 1-й этап связан с формированием и культивированием каллусов в жидкой среде (2-5 недель). Рост внесенных в культуру каллусов происходит, главным образом, за счет деления приповерхностных слоев каллусов 2-й этап продолжительностью 1 месяц связан с формированием гетерогенной суспензии, когда рост культуры идет за счет одиночных и агрегированных клеток, в которых выделяются клетки меристемоидного типа. Они начинают делиться и суспензия обогащается ими. Каллусные остатки удаляют просеиванием через сито (200 мкм). Таким образом,идет отбор клеток меристемоидного типа. Для более четкого отбора этих клеток используют высокие пробирки, где отстаивают суспензию, а затем отбирают средний слой (в верхнем слое мертвые, лопнувшие клетки в нижнем - плотные агрегаты каллу 2 сов), преимущественно состоящий из меристемоидных клеток и вносят в колбы со свежей питательной средой. За счет такой операции период субкультивирования клеток сокращается до 7-10 суток 3-й этап - это окончательное формирование истинной суспензионной культуры. Такая культура имеет ярко-желтый цвет, высокодиспергирована,морфологически выровнена, состоит из клеток круглой и овальной форм, с маловакуолизированной цитоплазмой и четко выраженным ядром и цитоплазматическими тяжами. Субкультивирование проводят 2 раза в неделю. Весь процесс получения эмбриогенной клеточной суспензионной культуры занимает 3-4 месяца. Активно растущая суспензионная культура дает регенерацию растений на твердой среде МурасигеСкуга с 1 мг/л индолилуксусной кислоты и 1 мг/л зеатина. Частота регенерации составляет 25-30 . 10834 Пример Для получения суспензии отбирали морфогенные каллусы, выделенные из тканей пыльников пшеницы. Колоски с пыльниками отбирались в полевых условиях, когда колос находился еще в трубке стебля и первый флатовый лист был расположен в середине этой трубки (4). Такое расположение листа и колоса соответствует формированию 4 ядерной пыльцы в пыльниках. Именно эта стадия пыльников способна к формированию морфогенных каллусов из них на питательной среде. Трубка с недоразвитым колосом стерилизовалась в асептических условиях 70 этанолом - 1 минуту 0,1 раствором сулемы - 5 минут затем трижды отмывали стерильной дистиллированной водой, после чего выделяли из них пыльники и помещали их на питательную среду Мурасиге-Скуга. Культивировали пыльники при 24-26 С в темноте, в течение 3 х недель, затем ярко-желтые каллусы гроздьевидной структуры отбирались для внесения в жидкую питательную среду для получения суспензионной культуры. В круглодонные колбы емкостью 250 мл с жидкой питательной средой МСА в объеме 15 мл, содержащей 2 мг/л 2,4-Д (дихлорфеноксиуксусную кислоту) 0,2 мг/л кинетина и 0,1 мг/л гиббереловой кислоты (при рН среды 5,8) вносили 2 г каллусов. Культивирование суспензии проводили на качалке при 119-121 оборотах в минуту на рассеянном свету и при температуре 24-26 С. Субкультивирование суспензии осуществляли 2 раза в неделю. Через 4 недели культивирования проводили отбор крупных агрегатов при пересадке (1-й этап). За счет деления одиночных и агрегированных клеток идет дальнейшее формирование гетерогенной суспензионной культуры. Удаление крупных агрегатов и паренхимных клеток, а также отбор меристемоидных клеток при отстаивании в высоких пробирках из среднего слоя приводит к большему выравниванию суспензии. Обогащение культуры идет за счет деления клеток меристемоидного типа. 2-й этап осуществляли в течение 3 месяцев. На 3-м этапе культивирования наблюдали суспензию ярко-желтого цвета, мелкоагрегированную,морфологически выравненную, представленную клетками меристемоидного типа с маловакуолизированной цитоплазмой и тонкой клеточной стенкой. Наблюдается активное деление клеток. Для осуществления регенерации клетки и крупные агрегаты при пересадке отбирались с помощью пипетки и высевались на питательную агаризованную среду Мурасиге-Скуга и доращивали до видимых микроколоний. Микроколонии с целью получения эмбриогенного каллуса переносили на ту же среду, обогащенную добавками гидролизата казеина, глютамина, аспарагина и кинетина. Концентрацию 2,4-Д с 2 мг/л снижали до 0,5 мг/л. Каллусы переносили в световую комнату и культивировали при 27 С и освещенности 800-1000 люкс. Через 4 недели каллусы переводили на регенерационную среду с половинным содержанием солей МС и с 1 мг/л индолилуксусной кислоты. Таким образом, можно получить активно растущую суспензионную культуру из каллусов пыльников пшеницы и способ может быть применим к пшенице различных генотипов и другим зерновым злакам. Состав среды МСА, мг/л 1. Макроэлементы МС 2. Микроэлементы МС 3. -хелат 4. Мио-инозитол 5. Никотинамид 6. Пиридоксин 7. Тиамин 8. Глицин 9. Глутамин 10. Аспарагиновая кислота 11. Сахароза 12. 2,4-Д 13. Кинетин 14. Гиббереловая кислота рН 5,8 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения эмбриогенной суспензионной клеточной культуры зерновых, включающий введение каллусов в жидкую питательную среду с последующим культивированием на качалке при 119-121 оборотах в минуту, на свету, при температуре 2426 С, отличающийся тем, что используют каллусы, полученные из пыльников пшеницы на стадии 26-ядерной микропыльцы, которые вводят на обогащенную аминокислотами питательную среду.