Способ клонирования открытой рамки считывания (орс34к) геномной рнк pvm для определения супрессорной активности

(51) 12 1/21 (2006.01) 12 15/33 (2006.01) 12 15/63 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ определения супрессорной активности относится к области биотехнологии микроорганизмов,молекулярной биологии и генетической инженерии. Способ клонирования открытой рамки считывания (ОРС 34 К) геномной РНК М-вируса картофеля в векторную кассету с двойным 35 промотором,-терминатором и геном устойчивости к селективному антибиотику канамицину. Целевой фрагмент гРНКклонирован в растительный вектор 32 и может быть использован для определения супрессорной активности. Предлагается при конструировании рекомбинантных кассет,для определения супрессорной активности каких-либо ОРС фитовирусов,имеющих сельскохозяйственное значение для Республики. Рекомендуется следовать аналогичной описанной схеме. Любая нуклеотидная последовательность может быть клонированна сходным способом в соответствующий растительный вектор.(72) Крылдаков Руслан Владимирович Станбекова Гульшан Эсенбековна Наргилова Руфина Мустафаевна Писаренко Алена Михайловна Искаков Булат Кудайбергенович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожина Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ ОТКРЫТОЙ РАМКИ СЧИТЫВАНИЯ(ОРС 34 К) ГЕНОМНОЙ РНКДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТИ(57) Способ клонирования открытой рамки считывания (ОРС 34 К) геномной РНКдля Изобретение относится к области биотехнологии микроорганизмов, молекулярной биологии и генетической инженерии. М-вирус картофеля (К илиотМ) является фитовирусом, относящимися к родусемейства.К., ,// . . .-1991.-. 729-14. Частицы этих вирусов имеют вид гибких палочек и состоят из единственной однонитевой плюс - цепи геномной (г)РНК с мол. массой 2,4106 Да (8534 нуклеотида) и множества одинаковых субъединиц капсидного белка с мол. массой 34 кДа,которые упаковывают гРНК в виде спиралиЕ.,,,.//.-1984.-. 133.- .427-430.является экономически важным, т.к. потери урожая, вызванные инфекцией растений картофеля, обычно составляет около 20, но в сочетании с другими вирусами могут быть значительно выше(ОРС) гРНКкодирует полипептид (белок оболочки) размером 304 аминокислоты и мол. массой 33906 Да (ОРС 34 К). Эта ОРС начинается с-кодона в положении 7227 и заканчивается терминирующим кодоном в положении 8141. Ген белка оболочкилокализован в 3-концевой области генома иэкспрессируется при трансляции соответствующих субгеномных(сг)РНК, образующихся в зараженных клетках. Данная последовательность обладает супрессорной активностью., .,Т.,В.//.-2011.- . 9.-.-.1520. Известны несколько способов клонирования различных фитовирусных ОРС, экспрессирующих супрессоры РНК-интерференции (РНКи) .,, // .-1999.-.14147-14152. Их недостатками являются длительная протяженность по времени, сопряженные в связи с этим высокие расходы на реагенты и материалы. Прототипом является способ клонирования с помощью технологии,//.-2003.- .462-469, отличающийся вставкой целевой рамки вируса картофеля М между фланкирующими последовательностями вектора 32. Задачей изобретения является разработка способа клонирования одной из ОРС гРНКдля определения ее супрессорной активности. Клонирование целевого фрагмента гРНКв векторную кассету с 35-промотором, терминатором и геном устойчивости к селективному антибиотику канамицину. Амплифицированный фрагмент ОРС 34 К был клонирован сначала в вектор 207. В качестве селективного антибиотика использовался гентамицин. Клонирование происходило по рекомбинационным сайтами , с помощью комплекса ферментов ВР-клоназы. Далее, с использованием реакции -рекомбинации целевой фрагмент гРНКбыл клонирован в вектор 32 под контролем двойного 35 промотора вируса мозаики цветной капусты. В качестве селективного антибиотика использовался канамицин. ДНК-фрагмент, содержащий в своем составе последовательность ОРС 34 К,может быть синтезирован либо вырезан по рестриктирующим сайтам, и встроен в различные ДНК-конструкции, позволяющие изучить его состав и свойства более полно. Пример 1. В качестве примера приводится способ клонирования последовательности ОРС 34 К в -вектор под контролем двойного 35 промотора. Для амплификации целевого фрагмента гРНК(фиг.1) с помощью РОТ-ПЦР необходимо использовать пары специфических олигонуклеотидных праймеров. Фиг.1 - Нуклеотидная последовательность целевого гена ОРС 34 К гРНКПрямыеи обратныеолигонуклеотидные праймеры,использованные для создания плазмидных конструкций, указаны в таблице 1. Для удобства клонирования праймеры содержали на концах короткие последовательности, необходимые для дальнейшего встраивания в плазмидный вектор и клонирования в бактериях. Таблица 1 Олигонуклеотидные праймеры, использованные для амплификации открытой рамки считывания гРНКОРС ОРС 34 К С выделенным и очищенным препаратом гРНКс помощью обратных праймеров была проведена реакция обратной транскрипции (РОТ) и 2 получены кДНК, которые использовались в дальнейшем для проведения полимеразной цепной реакций (ПЦР). Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1 агарозном геле (фиг.2). Дорожки 1 и 2 - продукты ПЦР ОРС 34 К дорожка 3 - маркерные ДНК, размеры которых в нуклеотидах указаны справа. Фиг.2 - Электрофорез в 1 агарозном геле продуктов ПЦР кДНК гРНККлонирование амплифицированных кДНКфрагментов с ОРС гРНКв бактериальном векторе с использованием -технологии Бактериальный вектор 207,применяющийся втехнологии, ,М-//.-2000.-. 10.-.1788-1795.//..-2007.-.2(4).-.571-589 имеет в своем составе специфические последовательности,т.н.и 1, которые рекомбинируют с районами 1 и 2,находящимся соответственно на 5 и 3-концах амплифицированного кДНК-фрагмента гРНК . Олигонуклеотидные праймеры несли на своем 5-конце последовательность, которая формирует В 1-сайт. На 3-конце праймеры содержали последовательность ,которая формирует 2-сайт (таблица 1). В результате ВР-реакции с участием ферментовпроисходит рекомбинация 1 и 2(в составе ПЦР-продукта) соответственно с Р 1 и 2 (в составе вектора) с переходом ПЦР-продукта в состав вектора и с изменением рекомбинировавших фланговых последовательностей на 1 и 2 соответственно (фиг.3). Таким образом, был получен промежуточный вектор 207,несущий в своем составе вставку амплифицированного кДНК-фрагмента гРНК(т.н. -вектор). Треугольниками обозначены сайты рекомбинации. Целевой кДНК-фрагмент гРНКобозначен как- донорный вектор 207-промежуточный вектор 207 со вставкой целевого кДНК-фрагмента гРНК . Фиг.3 - Схема клонирования с использованиемтехнологии с участием ферментов рекомбинацииКлонирование амплифицированного кДНКфрагмента с ОРС гРНКв растительном векторе с использованием -технологии. Целевой кДНК-фрагмент гРНК,клонированный в состав -вектора 207,имеет на своих 5- и 3-концах специфические последовательности,т.н. 1 и 2,образовавшиеся в результате ВР- рекомбинации. Т.о. амплифицированный фрагмент может быть переклонирован в -вектор 32(фиг.4). Для этого проводилась реакция рекомбинации между -вектором 207 и вектором 32 в присутствии комплекса ферментов -, включающего белки рекомбинации (, , ). В результате рекомбинации между участками-вектора 207 и участками-вектора 32, целевой фрагмент гРНКбыл перенесен в состав -вектора 32 под контролем двойного 35-промотора. Треугольниками обозначены сайты рекомбинации целевой фрагмент гРНКобозначен- промежуточный вектор 207-вектор назначения 32 с целевым фрагментом гРНКв составе. Фиг.4 - Схема клонирования с использованиемтехнологии с участием ферментов рекомбинации. Необходимый фрагмент гРНКвстраивался в векторную кассету с необходимым промотором,терминатором и геном устойчивости к селективному антибиотику. Амплифицированный фрагмент ОРС 34 К был клонирован сначала в вектор 207. В качестве селективного антибиотика использовался гентамицин. Клонирование происходило по рекомбинационным сайтами, с помощью комплекса ферментов ВР- клоназы. Далее, с использованием реакции -рекомбинации целевой фрагмент гРНКбыл клонирован в вектор назначения 32 под контролем двойного 35 промотора вируса мозаики цветной капусты . В качестве селективного антибиотика использовался канамицин. Технико-экономический эффект заключается в сокращении времени при клонировании полноразмерных вирусных ОРС в растительные векторы для определения их супрессорной активности, экономии реактивов и материалов. Достигаемый технический результат клонирование полноразмерных вирусных ОРС в растительный вектор для определения их супрессорной активности. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ клонирования открытой рамки считывания (ОРС 34 К) геномной РНКдля определения супрессорной активности,включающий растительный вектор 32 и клонирование по-технологии,отличающийся тем, что целевой фрагмент гРНКклонирован в вектор 32 для определения супрессорной активности. 5-726173217381744175013