Штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp kurstaki для получения биоинсектицида

(51) 12 1/20 (2006.01) 01 7/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ образующий спор штамм-105 для получения на его основе экологически безопасного, не содержащего живых спор энтомоцидного биопрепарата для борьбы с насекомыми отряда- вредителями сельского хозяйства. Сущность изобретения штамм получен из аспорогенного штамма 6- в результате направленного мутагенеза УФ-лучами, депонирован в коллекции культур микроорганизмов ТОО КАЗНИИППП под номером В - 483. Для получения биоинсектицида штамм выращивают на среде, содержащей кормовые дрожжи, пшеничную муку, марганец сернокислый,кальций хлористый и водопроводную воду.(72) Тен Олег Андреевич Балпанов Дархан Серикович Парамонова Ирина Евгеньевна Фоменко Марина Владимировна Изобретение относится к микробиологической промышленности, производство энтомоцидных бактериальных препаратов. Выпускаемые в настоящее время энтомопатогенные препараты на основе .содержат смесь сухих спор и кристаллов -эндотоксина. Хотя известно, что основным действующим началом является белковый инсектицидный -эндотоксин и наличие спор является не обязательным. Титр жизнеспособных спор в препаратах достигает 60-100 млрд/г. При применении таких препаратов белковые кристаллы разлагаются и через некоторое время исчезают,тогда, как споры благодаря своей устойчивости продолжают длительное время существовать и в благоприятных условиях могут прорастать и размножаться,приводя к нежелательным нарушениям экологического равновесия среди почвенных микроорганизмов. В связи с этим перспективным является создание бесспоровых биоинсектицидов еще более экологически безопасных, чем существующие средства защиты растений (СЗР). Известно, что подвиды В.., токсичные для гусениц насекомых отряда, вырабатывают кристаллические белки размером приблизительно в 130 и 70 килодальтон(кДа). Характерной чертой кристаллических белков является их способность сращиваться в форме кристаллов внутри материнской клетки В.. При лизисе материнской клетки белки высвобождаются во внешнюю среду в виде кристаллов (Добрица А.П, Корецкая Н.Г., Гайта В.И., Коломбет Л.В. Дербышев В.В., Жиглецова С.К. Разработка биопестицидов против колорадского жука //Ж. Рос. хим. общества им. Менделеева. - 2001. т. .5-6). Известен штамм В..Н 3(А.с. СССР 1367484, 1985). Недостатком указанного штамма является более низкая энтомоцидная активность и меньший выход-эндотоксина, чем у предлагаемого штамма. Известен аспорогенный штамм В..7-А (А.с. РФ 2033721, 1995). Недостатком указанного штамма является невысокий выход -эндотоксина (в среднем 3,45 мг/мл). Известен штамм В..М 6-А аспорогенный. Однако недостатком указанного штамма также является более низкий выход -эндотоксина, чем у предлагаемого штамма. Для достижения цели предлагается аспорогенный штамм.-105. Штамм хранится в коллекции культур ТОО Научно-аналитический центр 2 Биомедпрепарат и депонирован в коллекции культур микроорганизмов ТОО КАЗНИИППП(коллекционный номер В -483). Штамм -105 получен из штамма М 6-А путем направленного мутагенеза УФ - лучами и последующей селекции по признаку высокого токсинообразования. Штамм МА-105 характеризуется следующими признаками. Морфолого-культуральные признаки. Аэроб. Грамположительный. Оптимум роста 2930 С. Вегетативные клетки крупные подвижные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами или цепочками. Размер клеток(1,5-1,7)(3,6-6,2) мкм. В стационарной фазе развития продуцируются белковые кристаллические включения ромбовидной формы размером(0,4-0,7)(1,1-2,2) мкм. Морфологической особенностью клеток продуцента является отсутствие стадии образования спор и наличие в клетке двух и более белковых параспоральных включений - кристаллических токсинов. Характер роста на различных питательных средах. На рыбо-пептонном агаре (РПА) через 2 суток инкубации образуются округлые серовато-бежевого цвета приподнятые колонии диаметром 3-5 мм с изрезанным краем, матовой крупнозернистой поверхностью, пастообразной, слегка творожистой консистенцией. На мясо-пептонном бульоне образуется равномерная муть. Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Использует глюкозу, мальтозу, крахмал, целлобиозу, салицин,эскулин. Не утилизирует сахарозу, маннозу, маннит,лактозу. Отношение к источникам азота. Усваивает аммонийные формы азота. Восстанавливает нитраты. Молоко пентонизирует. Желатину разжижает. Мочевину разлагает. Образует лецитиназу. Патогенные свойства. Не продуцирует термостабильный экзотоксин. Патогенен для многих видов насекомых из рода чешуекрылых. Не токсичен для теплокровных животных. Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Аспорогенную культуру.шт. 6- культивируют в 15 мл питательной среды МПБ в колбах Эрленмейера на 250 мл в шейкер-инкубаторе при температуре(291)С, при 240 мин-1 в течение 6 ч до стадии молодых вегетативных клеток. Пример 1. Получение активного штамма Культуральную жидкость на стадии молодых вегетативных клеток охлаждают во льду в течение 5 минут, разливают на порции по 5 мл и центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 5 мин. Осадок каждой порции ресуспендируют в 2,5 мл стерильного раствора 0,1 М 4,суспензию разливают в чашки Петри по 3 мл. Культуру облучают УФ-лучами в открытых чашках Петри в течение 30 мин. В качестве контроля используют необлученную суспензию. Облученную суспензию далее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, осадок клеток ресуспендируют в 15 мл питательной среды ФС ,состава г/л пшеничная мука ( сорт) - 15,0 кормовые дрожжи - 30,0 кальций хлористый - 1,5 марганец сернокислый - 0,2 вода водопроводная до 1 л. Культуру инкубируют в шейкер-инкубаторе при 240 мин-1 в течение 16 ч при температуре (291)С в колбах, обернутых алюминиевой фольгой в темноте во избежание фотореактивации. С целью получения изолированных колоний культуральную жидкость рассевают в чашки Петри с питательной средой МПА и культивируют при температуре (291)С в течение 48 ч. Полученные изоляты для проверки продуктивности (содержание белка -эндотоксина) культивируют на питательной среде ФС , разлитой в колбы Эрленмейера по 30 мл на круговой качалке со скоростью вращения 240 об/мин при температуре 30 С в течение 36 ч. Отбирают клоны с наиболее высокой продуктивностью по содержанию белка-эндотоксина. Клон,показавший наиболее высокую продуктивность, подвергают повторному облучению УФ-лучами и далее отбирают клоны,отличающиеся по морфологии и токсинообразованию от клонов родительского штамма. Из клонов, проявивших наиболее высокие показатели по содержанию белка -эндотоксина и отличающихся по морфологическим признакам получен мутантный штамм-105. Предлагаемый штамм хранится на скошенном рыбо-пептонном агаре в холодильнике при температуре плюс (0-6)С. В таблице 1 приведены результаты направленного мутагенеза УФ-лучами,подтверждающие получение нового продуктивного штамма. Таблица 1 Продуктивность и морфология колоний культурыпосле УФ-облучения Наименование культуры Колебания продуктивности отдельных колоний по содержанию белка-эндотоксина, мг/мл Морфология колоний на РПА Штамм после первого облучения УФ-лучами Штамм после второго облучения УФ-лучами Округлые сероватобелого цвета плоские колонии диаметром 3-5 мм со слегка волнистым краем,матовой мелкозернистой поверхностью,пастообразной, слегка творожистой консистенцией. Округлые сероватобежевого цвета приподнятые колонии диаметром 3-5 мм с изрезанным краем,матовой мелко- и крупнозернистой поверхностью,пастообразной, слегка творожистой консистенцией. Округлые сероватобежевого цвета приподнятые колонии диаметром 3-5 мм с изрезанным краем,матовой крупнозернистой поверхностью,пастообразной, слегка творожистой консистенцией. Как видно из табличных данных получен активный штамм-105, отличающийся от аналогаМ 6 - А повышенной способностью к биосинтезу белка- эндотоксина и морфологическими признаками при культивировании на агаризованной питательной среде. Пример 2. В таблице 1 приведены сравнительные данные по содержанию белка-эндотоксина при культивировании штаммовна питательной среде ФС . Таблица 2 Сравнительная оценка штаммов- продуцентов белка -эндотоксина Наименование штаммашт. -52 В.шт. 7 шт. ИПМ-2 ашт. М 6 -шт. -105 Наличие спор и белковых кристаллов споровый аспорогенный аспорогенный Из данных, представленных в таблице 2, следует,что продуктивность предлагаемого шт. МА-105 превосходит таковую штаммов культурыв среднем в 1,9 раза. Пример 3. Технология получения инсектицидного препарата. Суспензией в количестве 5 (об.), полученной в результате смыва культуры МА-105 стерильной дистиллированной водой со скошенной агаризованной питательной среды, засевают питательную среду ПС, состава г/л соевая мука 10,0 крахмал картофельный - 10,0 аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 3,0 вода дистиллированная - до 1 л. Объем питательной среды в колбе - 30 мл. Культивирование осуществляют в колбах Эрленмейера на 750 мл при температуре (291)С, аэрации - 240 мин-1 в течение 6-7 ч (до фазы молодых вегетативных клеток). Далее культивирование предлагаемого штаммаМА-105 проводят в течение 26-30 часов глубинным методом в биореактореобъемом 130 л при постоянной скорости вращения мешалки 450 об/мин и подаче воздуха 1 л/1 л в мин на ферментационной питательной среде ФС . Полученную при глубинном культивировании культуральную жидкость концентрируют методом центрифугирования при 10000 оборотах/мин в течение 15 минут. В качестве наполнителя в пасту вводят следующие компоненты,сульфат аммония - 10,0 тиомочевина- 0,7 уксусная кислота 1,0. Готовый препарат в виде пасты содержит от 46 до 54 мг/г белка -эндотоксина. Пример 4. Испытание опытного образца биологического препарата на основе штаммаМА-105 Испытания препарата проведены в полевых условиях сельскохозяйственного предприятия Баянбай, ТОО Есиль Агро, Бурабайский р/н,Акмолинской области против представителей чешуекрылых насекомых отряда(на рапсе - против гусениц капустной белянки. и на пшенице яровой - против гусениц серой зерновой совки.). Расход препарата составил 2,5 - 3,0 л/га. Обработка посевов проведена в период массовой бутонизации и в начале созревания против гусениц капустной белянки и в начале молочной спелости зерна против серой зерновой совки путем сплошного наземного опрыскивания самоходным опрыскивателем Джон Дир. В процессе испытаний установлено биологическая эффективность препарата после обработки на 7-й наблюдения (доза расхода 2,5 3,0 л/га) против капустной белянки составила 50,5 60,4 и находится на одном уровне с эталоном(химический препарат Димилин, с.к. с нормой расхода 0,04 - 0,05 л/га). Наибольшая урожайность получена при максимальных нормах расхода препарата (3,0 л/га). Биологическая эффективность препарата после обработки на 7-й день наблюдения(доза расхода 2,5 - 3,0 л/га) против серой зерновой совки составила 57,2 - 60,5 и превысила эффективность, взятого в качестве эталона биологического препарата Биотурин,аспорогенный в среднем на 7,2. Использование предлагаемого препарата обеспечило сохранность урожая от потерь,причиняемых вредителями во всех нормах расхода. Величина прибавок урожая соответственно нормам расхода на эталонном и варианте с испытываемым препаратом была идентичной. Наибольшая урожайность получена при максимальных нормах расхода. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий.МА-105, депонированный в Коллекции культур ТОО КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности под номером -483, для получения биоинсектицида для борьбы с насекомыми отряда .