Штамм бактерии brucella melitensis b-0122, используемый для приготовления бруцеллезного антигена при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных

(51) 12 1/20 (2006.01) 61 39/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании штамма бруцелл,для приготовления эффективного бруцеллезного антигена для серологических реакций. Штамм бактерииВ-0122,депонирован в лаборатории генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления бруцеллезного антигена при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Оспанов Ержан Калиолдинович Мырзалиев Ахан Жахангерович Даугалиева Аида Тлековна Адамбаева Акмарал Ауелхановна Шманова Баламзия Тастановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ШТАММ БАКТЕРИИ-0122, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Известен вакцинный штамм 19,используемый для получения -бруцеллезных диагностикумов Иванов Н.П. Бруцеллез животных методы и средства борьбы с ним.- Алматы, 2002,с.300-301 с.308-315. Недостатком антигена, приготовленного из штамма 19 для серологических реакций, является его относительно невысокая чувствительность и специфичность, который отличается по своей антигенной структуре от штаммов бруцелл, циркулирующих в РК. Задачей изобретения является получение высокочувствительного штамма бруцелл с типичными культурально-морфологическими,биохимическими, антигенными свойствами для серологической диагностики бруцеллеза,вызываемого - формами возбудителя. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в изыскании штамма бруцелл,для приготовления эффективного бруцеллезного антигена для серологических реакций. Штамм бактерииВ-0122 депонирован в лаборатории генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления бруцеллезного антигена при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Идентификацию штамма бактерииВ-0122 проводят по морфологическим,культуральным и физиолого-биохимическим свойствам. Происхождение штамма бактерии. Штамм бактерии выделен от больного бруцеллезом мелкого рогатого скота из сельского округа Бауыржан,Энбекшиказахского района Алматинской области. Способ выделения - МПБ, МПА, эритрит агар с добавками и отбор колоний в -форме по УайтВильсону. Идентифицирован согласно определителю бактерии,2005,, .370-386. Сравнен с типовым коллекционным штаммом 16 М (эталонный). Назначение штамма бактерии. Штамм типовой для приготовления диагностических препаратов обладает-антигенными детерминантами. Повышает эффективность серологической диагностики бруцеллеза животных. Состав среды и условия культивирования панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид, глюкоза, глицерин, агар-агар,дрожжевой экстракт, -цистин.Т 37-38 С, рН 6,87,0. 2 Морфолого-культуральные свойства. Бруцеллы - грамотрицательные коккобациллы,длиной 0,4-2,2 мкм, шириной 0,4 - 0,6 мкм,неподвижны,очертания концов округлые,клеточные стенки содержат липополисахарид,консистенция -формы. Вегетативные клетки растут на эритрит-агаре с добавками, Т 37-38 С, в течение 48 часов в термостате и обладают сравнительно короткой лагфазой и более активными ростовыми свойствами,сопровождающейся накоплением более высокого количества бактериальной массы. Так за 48 часов культивирования в термостате на эритрит агаре,накопление бактериальной массы составляло более 800 миллиардов микробных клеток в 1,0 см 3. При повторной проверке выбранного штаммаВ-0122, через 3 месяца после хранения на эритрит агаре под резиновыми пробками, была установлена его стабильность в быстроте роста, что указывало на целесообразность его использования для изготовления диагностических препаратов. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм. Источники углерода глюкоза,глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты уреаза, оксидаза,каталаза, не образует сероводород, не разжижает желатин, не лизирует эритроциты, не образует ацетилметилкарбинол. Антигенная структура. Содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных для форм бруцелл, то есть агглютинируются антибруцеллезными сыворотками в титре 1160 образуя крупные рыхлые хлопья агглютината и не вступает в реакцию с -антибруцеллезной сывороткой. Маркерные признаки штамма. Растет на средах с пенициллином, обладает уреазной, оксидазной,каталазной активностью. Серологические свойства. Антиген из бруцелл данного штамма, обладает высокой эффективностью при исследовании сывороток крови животных их хозяйств,неблагополучных по бруцеллезу. Выявляет дополнительно к биофабричному бруцеллезному антигену до 5 инфицированных животных. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Голота установлено, чтоВ-0122 имеет высокую вирулентность. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах. В нативном состоянии не снижает активности 4 месяцев на твердых средах (эритрит-агар) при температуре 4-6 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма эритрит агар с добавками (дрожжевой экстракт, -цистин, 1 глюкоза, 2 глицерин). Проба на диссоциацию. По Уайт-Вильсону колонии окрашиваются в желтый цвет (-форма). Проба с трипафлавином и реакция термоагглютинации - отрицательные. Молекулярно-биологические характеристики гена 16 штамма В.280. Молекулярно-биологические характеристики гена 16 штамма В.280,выражаются в нуклеотидных последовательностях,электрофореграмме и дендрограмме. Пример 1. Из штаммаВ-0122 ДНК выделяют методом проводят универсальными праймерами 8 и 806 в общем объеме 30 мкл. ПЦР смесь содержит 150 нг. ДНК, 1 Ед.,0,2 каждого дНТФ, 1-х ПНР буфер ,2,52, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включает денатурацию 95 С в течение 7 минут 30 циклов 95 С - 30 секунд, 55 С- 40 секунд, 72 С -1 минута заключительная элонгация 7 минут при 72 С. ПЦР продукты очищают при помощи ферментов 1 и щелочной фосфатазы(, ). Реакцию секвенирования проводят с применением 3.1() согласно инструкции производителя. Продукт реакции секвенирования очищают колоночным методом -. Очищенные фрагменты разделяют на автоматическом генетическом анализаторе 3500). Нуклеотидные последовательности 16 гена штамма анализируют и объединяют в общую последовательность в программном обеспечении 2.6.0 ( ). После чего удаляют концевые фрагменты(нуклеотидные последовательности праймеров,фрагменты, имеющие низкий показатель качества) что позволяет получить нуклеотидную последовательность протяженностью более 650 п.н.,которую идентифицируют впо алгоритму. Нуклеотидные последовательности и результаты идентификации представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что нуклеотидная последовательность гена 16 штамма В.280, имеет 100 совпадением с известными последовательностями штаммов В., В.и В. . Проводят проверку чистоты штамма, которую осуществляют на основе анализа электрофореграммы нуклеотидной последовательности 16 гена. В таблице 2 представлена электрофореграмма фрагментов нуклеотидной последовательности анализируемого гена В.280. Как показано в таблице 2, у анализируемого штамма отсутствует смешение сигналов, что свидетельствует об отсутствии в культуре посторонних видов бактерий. Проводят построение филогенетического древа с нуклеотидными последовательностями 16 гена,филогенетически наиболее связанных микроорганизмов. Для построения филогенетических деревьев используют программное обеспечение -3.1. Используют алгоритмдля выравнивания нуклеотидных последовательностей, построение древ проводят с использованием метода присоединения ближайших соседей (- ), который приведен в таблице 3. Как видно из таблицы 3, анализируемый штамм находится на одной филогенетической ветви с разновидностями рода . Результаты идентификации штамма по гену 16 приведены в таблице 4. Как показано в таблице 4, учитывая высокую степень однородности нуклеотидной последовательности гена 16 у всех разновидностей. (100), проведенный анализ не позволяет проводить видовую идентификацию бруцелл. Пример 2. Культуры бактерииВ-0122 выращивают на твердой питательной среде в течение 3 суток с последующим их смывом 0,5 фенолизированным раствором,полученную бактериальную суспензию фильтруют через двойной марлевый фильтр, определяют количество микробных клеток и прогревают в водяной бане при температуре 80 С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Затем полученную взвесь бруцелл проверяют на чистоту и стерильность путем высева на питательные среды, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осадок доводят 0,5 формалинизированным физиологическим раствором до 100 млрд. микробных клеток в 1,0 см 3 и расфасовывают по 50,100, 200 см 3 в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и хранят в рефрижераторе при 4-8 С до приготовления бруцеллезного антигена для ПРА,РА, РСК/РДСК и КР с молоком. Использование предложенного штамма, который эпизоотически актуален для Республики Казахстан,позволяет получать максимальный выход бактериальной массы для изготовления антигенов при серологической диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Изготавливаемые из штамма бактерииВ-0122 антигены для серологических реакции ПРА, РА,РСК/РДСК и КР с молоком при диагностике бруцеллеза животных являются чувствительными и специфичными и позволяют дополнительно выявлять инфицированных животных к известным антигенам. Таблица 1 Результаты идентификации гена 16 Идентификация нуклеотидных последовательностей в международной базе данных( Нуклеотидная последовательность гена 16 гштамма В.280 Таблица 2 Электрофореграмма фрагмента нуклеотидной последовательности гена 16 штамма В 280 Таблица 3 Дендрограмма, построенная на основании гена 16 Таблица 4 Результат идентификации гена 16 гштамма В.280 Наименование 280 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерии 280 В-0122 депонирован в лаборатории генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления бруцеллезного антигена при диагностике бруцеллеза сельскохозяйственных животных.