Способ получения овисного антигена из R-форм бруцелл для пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 10/00(2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий вырашивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание,суспендирование,инактивирование, окрашивание, ресуспендирование в буферном разбавителе и стандартизацию, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерийВ-0176 КазНИВИ 63/290, содержащий в своем составе-формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут с последующим их смывом с физиологическим раствором,фильтруют через четырехслойной марлевый фильтр,затем взвесь бруцелл инактивируют при температуре 70 С в течение 1 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость удаляют,а осадок ресуспендируют физиологическим раствором до концентрации 200 млрд микробных клеток в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности,затем полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2, после чего полученный дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспендируют физиологическим раствором, после чего полученую бактериальную массу окрашивают 0,2 раствором красный С 6, затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе с 11,3 и используют в качестве овисного антигена.(72) Султанов Ахметжан Акиевич Барамова Шолпан Аузаровна Мырзалиев Ахан Жакангерович Оспанов Ержан Калиолдинович Адамбаева Акмарал Ауелхановна Шманова Балымзия Тастановна Матихан Нурали Тусипканулы Оралкан(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Жанбырбаев М.Ж.,Кляцкий В.Г. Диагностическая эффективность овисного антигена в ПРА. Труды КазНИВИ, т. 48, Алматы, 2000, с.109113(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВИСНОГО АНТИГЕНА ИЗ -ФОРМ БРУЦЕЛЛ ДЛЯ ПЛАСТИНЧАТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного овисного антигена изформ бруцелл для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Способ получения овисного антигена изформ бруцелл для пластинчатой реакции Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Известен способ получения овисного антигена из бруцелл для пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий вырашивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание, суспендирование, инактивирование,окрашивание, ресуспендирование в буферном разбавителе и стандартизацию Жанбырбаев М.Ж.,Кляцкий В.Г. Диагностическая эффективность овисного антигена в ПРА. Труды КазНИВИ.- том 48- Алматы, 2000. - с. 109-113. Недостатком данного способа является то, что при исследовании выявляется не все зараженные животные. Задачей изобретения является получение высокоактивного овисного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации и повышение чувствительности способа, а также сокращение времени для получения результатов при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного овисного антигена изформ бруцелл для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Способ получения овисного антигена изформ бруцелл для пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание,суспендирование,инактивирование, окрашивание, ресуспендирование в буферном разбавителе и стандартизацию, в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерийВ-0176 КазНИВИ 63/290, содержащий в своем составе-формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут с последующим их смывом с физиологическим раствором,фильтруют через четырехслойной марлевый фильтр,затем взвесь бруцелл инактивируют при температуре 70 С в течение 1 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость удаляют,а осадок ресуспендируют физиологическим раствором до концентрации 200 млрд микробных клеток в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности,затем полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2, после чего полученный дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспендируют физиологическим раствором, после чего полученую бактериальную массу окрашивают 0,2 раствором красный С 6, затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно, центрифугируют при 6000 об/мин в 2 течение 20 мин, полученную надосадочную жидкость отбрасывают,при этом осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе с 11,3 и используют в качестве овисного антигена. Способ получения овисного антигена состоит в следующем. Пример 1. КультуруВ-0176 КазНИВИ 63/290 выращивают на твердой питательной среде, смывают, фильтруют через четырехслойной марлевый фильтр, после чего,полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 1 ч. Затем бактериальную взвесь проверяют на чистоту и стерильность микроскопический путем посева на питательные среды. После чего центрифугирует при 6000 об/мин в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют физиологическим раствором до концентрации 200 млрд микробных клеток в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича. Полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 кгц и мощностью 70-90 вт/см 2,генерируемых аппаратом УЗДН-1. После ультразвукового воздействия полученный дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, после чего надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют физиологическим раствором и окрашивают 0,2-ным водным раствором краски красной 6 С путем смешивания микробной суспензии с раствором краски в соотношении 51. Смесь выдерживают в течение двух часов при постоянном встряхивании. Окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, полученную надосадочную жидкость отбрасывают, при этом осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе до концентрации 100 млрд. микробных клеток и довестираствора до 11,2-11,3 путем добавления 10,0 . Пример 2. Пластинчатая реакция агглютинации(ПРА) с овисным антигеном применяют для исследования сывороток крови при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Реакцию проводят на чистых белых сухих эмалированных пластинках с лунками при температуре 18-30 С. Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 см 3 вносят на дно лунки микропипеткой, куда рядом вносят 0,03 см 3 антигена, которые тщательно в каждой лунке смешиваются ручным смесителем до получения однородной смеси, распределяя при этом, по всей поверхности лунки. Пластику со смешанными сыворотками и антигеном покачивают в течение 1 минут осторожным вращательными движениями, по истечении которого проводят визуальный учет результатов реакции. При положительной реакции в течение 1 мин появляются мелкие хлопья агглютината, в виде кольца по краю лунки. Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно окрашена). В начале работы одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли с негативными и позитивными сыворотками. Специфичность предложенного овисного антигена, отражены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что при сравнительном испытании специфичности предложенного овисного антигена в ПРА и в реакцией длительного связывания комплемента (РДСК) с биофабричным овисным антигеном,при исследовании сальмонеллезных, лептоспирозных, пастереллезных,хламидиозных,иерсиниозных,бруцеллезных,овисных сывороток крови, во всех случаях были отрицательные результаты, кроме последнего, что свидетельствуют о специфичности приготовленного диагностикума. Специфичность и чувствительность ПРА с разработанным цветным антигеном в сравнении с РДСК официально принятого при исследовании животных на инфекционный эпидидимит баранов изучали также путем исследования сывороток крови кроликов зараженных различными штаммами бруцелл. Для исследования брали 12 сывороток крови кроликов, которые были заражены различными штаммами бруцелл В. 63/290, В. 424/2,В. 1824, В. 19 по три головы каждый, а также три сыворотки от здоровых животных для контроля (интакные). Кров от кроликов брали для исследования после их заражения на 7, 14, 21, 28 сутки. Результаты диагностических исследований сывороток крови кроликов на инфекционный эпидидимит показаны в таблице 2. Как видно из данных таблицы 2, на 7 день исследования животных после их заражения штаммами В. положительные реакции в ПРА были получены с испытуемым антигеном в 7 пробах из 9, а в РДСК результаты всех проб крови оказались отрицательными. При последующем исследовании на 14, 21, 28 сутки все пробы сывороток крови животных, взятые в эти дни, в ПРА реагировали положительно. Тогда как в РДСК на 14 сутки прореагировало сыворотки крови от 5 зараженных животных, а на 21 и 28 сутки всего - 7 проб. При этом во всех сроках исследования интакных и зараженных бруцеллезным . 19 штаммам животных результаты ПРА с испытуемым овисным антигеном и РДСК с биофабричным антигеном были отрицательными. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено,что ПРА с разработанным диагностикумом превосходит по результативности РДСК с биофабричным овисным антигеном при исследовании сывороток крови животных,значительно сокращает время постановки реакции, позволяет получить диагноз в короткие сроки, что способствует предотвращению распространения заболевания путем своевременной изоляции больных бруцеллезом животных. Таблица 1 Специфичность предложенного овисного антигена Исследуемые сыворотки Сальмонеллезный Лептоспирозный Пастереллезный Хламидиозный Иерсиниозный Бруцеллезный Овисный Примечание- положительный,- - отрицательный результат. Результаты серологических реакций ПРА с испытуемым РДСК с биофабричным овисным овисным антигеном антигеном 15 110 Таблица 2 Специфичность и чувствительность овисного антигена в ПРА Штаммы бруцелл Результаты серологических реакций после заражения 7 день 14 день 21 день 28 день ПРА РДСК ПРА РДСК ПРА РДСК ПРА РДСК Результаты серологических реакций после заражения 7 день 14 день 21 день 28 день ПРА РДСК ПРА РДСК ПРА РДСК ПРА РДСК ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения овисного антигена из-форм бруцелл для пластинчатой реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмывание, суспендирование, инактивирование,окрашивание, ресуспендирование в буферном разбавителе и стандартизацию, отличающийся тем,что в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерийВ-0176 КазНИВИ 63/290, содержащий в своем составе-формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде в течение 3 суток с последующим их смывом физиологическим раствором, фильтруют через четырехслойной марлевый фильтр,затем взвесь бруцелл инактивируют при температуре 70 С в течение 1 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин,полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют физиологическим раствором до концентрации 200 млрд микробных клеток в 1 см 3 по оптическому стандарту мутности, затем полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 кГц и мощностью 90 Вт/см 2, после чего полученный дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспендируют физиологическим раствором, после чего полученую бактериальную массу окрашивают 0,2 раствором красный С 6, затем окрашенную взвесь промывают физиологическим раствором трехкратно,центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,полученную надосадочную жидкость отбрасывают,при этом осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе с рН 11,3 и используют в качестве овисного антигена.