Способ получения цветного антигена из R-форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов

(51) 61 39/10 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) 01 33/531 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Способ получения цветного антигена из -форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий вырашивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием, суспендированием, окрашиванием,ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию,в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий 424/2, содержащий в своем составе -формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе,полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 3 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой,затем к взвеси добавляют 1 сульфат магния и выдерживают в водяной бане при температуре 37 С в течение 30 мин, после чего антиген отмывают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем супернатант удаляют, а осадок окрашивают 0,1 раствором красно-фиолетовый 2 КТ,окрашенную взвесь промывают дистиллированной водой трехкратно,центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,полученную надосадочную жидкость отбрасывают,при этом осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе с рН 7,0-7,2 и используют в качестве цветного антигена.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Мырзалиев Ахан Жакангерович Оспанов Ержан Калиолдинович Шманова Балымзия Тастановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Алимбекова М.Е. Диагностика бруцеллеза сельскохозяйственных животных и инфекционного эпидидимита баранов в реакции агглютинации с помощью цветных антигенов Дисс. канд. вет. наук / ДГП НИВИ, Алматы, 2006, с.58-70(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦВЕТНОГО АНТИГЕНА ИЗ -ФОРМ БРУЦЕЛЛ ДЛЯ ПРОБИРОЧНОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОГО ЭПИДИДИМИТА БАРАНОВ(57) Способ получения цветного антигена из форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного цветного антигена из -форм бруцелл для постановки пробирочной реакции Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Известен способ получения цветного антигена из-форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием,суспендированием,окрашиванием, ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию Алимбекова М.Е. Диагностика бруцеллеза сельскохозяйственных животных и инфекционного эпидидимита баранов в реакции агглютинации с помощью цветных антигенов Дисс. . . . канд. вет. наук / ДГП НИВИ,Алматы, 2006, с.58-70. Недостатком данного метода является то, что применение названного метода выявляет не всех зараженных животных. Задачей изобретения является получение высокоактивного цветного антигена из штамма 424/2 для постановки пробирочной реакции агглютинации с сыворотками крови и повышение чувствительности метода, а также сокращение времени для получения результатов при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного цветного антигена из -форм бруцелл для постановки пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Способ получения цветного антигена из -форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита баранов, включающий выращивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием, суспендированием, окрашиванием,ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию,в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий 424/2, содержащий в своем составе -формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде, смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе,полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 3 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой,затем к взвеси добавляют 1 сульфат магния и выдерживают в водяной бане при температуре 37 С в течение 30 мин, после чего антиген отмывают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем супернатант удаляют, а осадок окрашивают 0,1 раствором красно-фиолетовый 2 КТ,окрашенную взвесь промывают дистиллированной водой трехкратно,центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,полученную надосадочную жидкость отбрасывают,при этом осадок ресуспендируют в 0,5 2 фенолизированном физиологическом растворе с рН 7,0-7,2 и используют в качестве цветного антигена. Способ получения цветного антигена состоит в следующем. Пример 1. Культуруиз штамма 424/2 выращивают на твердой питательной среде в течение 3 сут с последующим их смывом с физиологическим раствором рН-8,2-9,4, фильтруют через четырехслойный марлевый фильтр, затем инактивируют полученную взвесь бруцелл при температуре 70 С в течение 3 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой, а затем к взвеси добавляют 1 сульфата магния в качестве фиксирующего вещества краски к антигену и выдерживают в водяной бане при 37 С - 30 мин,затем антиген отмывают от фиксатора путем центрифугирования,осадок антигена ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 15 и взвесь окрашивают добавлением раствора краски красно-фиолетовый 2 КТ до 0,1-0,2-ной концентрации и выдерживают в водяной бане при 70 С - 20 мин, затем в холодильнике 1 ч. Затем окрашенный антиген промывают дистиллированной водой, трехкратно, путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 20 мин, при этом надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе,тщательно перемешивают и помещают в холодильник на 24 ч,после чего встряхивают, фильтруют через четырехслойную марлю, рН которой должен быть доведен до 7.0-7.2. Пример 2. Пробирочную реакцию агглютинации с цветным овисным антигеном проводят в чистых сухих стеклянных пробирках Флоринского. На наружной стенке пробирки указывают номер испытуемой пробы сывороток крови. Реакцию ставят на 2-ном растворев разведениях сывороток крови баранов 110, 120,140,180,1160 в количестве 0,5 мл каждого. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контроли с негативной и позитивной овисной сыворотками в тех же разведениях, как испытуемые. После этого в каждую пробирку вносят по 0,5 мл цветного антигена, предварительно разбавленного в соотношении 15 соответствующей концентрацией раствором хлорида натрия. Смесь исследуемых проб сывороток крови и цветного антигена тщательно перемешивают до получения однородной массы. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам цветного антигена, штативы с пробирками помещают в термостат при температуре 37-38 С на 4 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят учет реакции. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по следующей схеме(4 креста) - полное просветление жидкости,агглютинат оседает на дно пробирки в виде цветного зонтика(3 креста) - полное просветление жидкости,и хорошо выраженный зонтик(2 креста)- не просветление жидкости, зонтик умеренно выражен(1 креста)- едва заметно просветление жидкости, зонтик выражен очень слабо За диагностический титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем в 2 креста, что соответствует количеству международных единиц антител в 1 мл сыворотки. Контролем служат заведомо отрицательная и положительная овисная пробы сывороток крови животных. Специфичность предложенного цветного антигена, отражены в таблице 1. Таблица 1 Специфичность предложенного цветного антигена Исследуемые сыворотки Результаты серологических реакции РА с испытуемым овисным РДСК с биофабричным овисным цветным антигеном антигеном 125 150 15 110 Сальмонеллезный Лептоспирозный Пастереллезный Хламидиозный Иерсиниозный Бруцеллезный Овисный Примечание- положительный,- - отрицательный результат. Таблица 2 Результаты серологических реакций,при исследовании сывороток крови баранов на инфекционный эпидидимит К-во Эпизоотическое Сыворотки крови исследованных состояние хозяйств РДСК с биофабричным Пробирочная РА с овисным голов овисным антигеном цветным антигеном Пол Сом Отр Пол Сом Отр 847 Благополучное 847 847 206 Неблагополучное 34 4 168 41 3 162 Из таблицы 1 видно, что при сравнительном испытании специфичности предложенного цветного антигена в реакции агглютинации и в РДСК с биофабричным овисным антигеном,при исследовании сальмонеллезных, лептоспирозных,пастереллезных, хламидиозных, иерсиниозных,бруцеллезных, овисных сывороток крови, во всех случаях были отрицательные результаты, кроме последнего, что свидетельствуют о специфичности приготовленного диагностикума. Специфичность и чувствительность пробирочной реакции агглютинации с разработанным цветным антигеном в сравнении общепринятым методом (РДСК с биофабричным овисным антигеном) изучали также путем исследования 1053 сывороток крови баранов из различных по эпизоотическому состоянию ферм(хозяйств) по инфекционному эпидидимиту баранов. Результаты серологических реакций при исследовании сывороток крови баранов на инфекционный эпидидимит, показаны в таблице 2. Как видно из данных таблицы 2, в благополучном по инфекционному эпидидимиту хозяйстве, все животные имели отрицательные показания как в РДСК с биофабричным овисным антигеном, так и в РА с разработанным антигеном, а при исследовании на инфекционный эпидидимит 206 проб сывороток крови баранов производителей из неблагополучных хозяйств получены следующие результаты в РДСК позитивные показания были в 34 случаях и в 4 проба давала сомнительный результат. В РА положительные результаты с разработанным овисным цветным антигеном получены в 41 случаях, при этом 1 животное реагировавшие сомнительно в РДСК, реагировала положительно в РА. Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что пробирочная реакция агглютинации с разработанным диагностикумом превосходит по результативности РДСК с биофабричным овисным антигеном при исследовании сывороток крови баранов,значительно сокращает время постановки реакции,позволяет получить диагноз в короткие сроки, что способствует предотвращению распространения заболевания путем своевременной изоляции больных бруцеллезом животных. Одним из основных преимуществ пробирочной РА с разработанным овисным цветным антигеном является значительное сокращение времени получения диагноза на инфекционный эпидидимит баранов уже через 4 ч после постановки реакции. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения цветного антигена из -форм бруцелл для пробирочной реакции агглютинации при диагностике инфекционного эпидидимита 3 баранов, включающий вырашивание бруцелл на питательной среде с последующим их смывом,отмыванием, суспендированием, окрашиванием,ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацию, отличающийся тем, что в качестве бактериальной культуры используют штамм бактерий 424/2, содержащий в своем составе -формы бруцелл, который выращивают на твердой питательной среде,смывают, после чего отмывают и суспендируют в физиологическом растворе, полученную суспензию инактивируют при 70 С в течение 3 ч, с последующим центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин, затем полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют дистиллированной водой, затем к взвеси добавляют 1 сульфат магния и выдерживают в водяной бане при температуре 37 С в течение 30 мин, после чего антиген отмывают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем супернатант удаляют, а осадок окрашивают 0,1 раствором красно-фиолетовый 2 КТ,окрашенную взвесь промывают дистиллированной водой трехкратно,центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,полученную надосадочную жидкость отбрасывают,при этом осадок ресуспендируют в 0,5 фенолизированном физиологическом растворе с рН 7,0-7,2 и используют в качестве цветного антигена.