Способ получения антигена для модификационной реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза собак

(51) 61 39/10 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения антигена для модификационной реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза собак, включающий выращивание штамма бруцелл, обеззараживание полученной культуры клеток, центрифугирование с последующим отделением надосадочной жидкости и стабилизирование,в качестве антигена используют штаммыВ-0267 иВ-0488, которые выращивают раздельно на эритрит агаре с добавками, полученную чистую культуру взвесей бруцелл каждого штамма смывают из пробирок стерильными физиологическими раствором, затем бактериальные суспензии каждого штамма бруцелл отдельно в концентрации 200 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллзному стандарту мутности центрифугируют трижды при 5000 об/мин в течение 30 мин, отмывают от примесей питательной среды,после чего бактериальные суспензии каждого из штаммов бруцелл доводят до 30 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности и подвергают разрушению мембраны штаммов бруцелл хлороформом, при этом хлороформ в течение 2 ч осаждают и удаляют, а два верхних слоя переносят раздельно в стерильные флаконы, затем оба антигена смешивают в равных объмах и титруют в модификационной реакции агглютинации с негативными и позитивными -и - сыворотками крови и получают целевой продукт.(72) Калыкова Гульжан Кентаевна Сейдахметова Роза Джаровна Зинина Надежда Николаевна Сарманов Абдымурат Мамырбекович Гуляева Оксана Владимировна Кожакова Ботагоз Кабышевна Еспембетов Болат Аманбаевич(73) Государственное учреждение Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии Комитета государственной инспекции в агропромышленном комплексе Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 4572, кл. А 61 К 39/10, 1997(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ МОДИФИКАЦИОННОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА СОБАК(57) Изобретение относиться к области ветеринарной бактериологии и иммунологии, и может быть использовано при серологической диагностике бруцеллза собак. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности, чувствительности и высокой активности в модификационной реакции агглютинации. Таблица Результаты испытаний активности и специфичности предлагаемого антигена в сравнении со стандартным единым бруцеллезным антигеном Результаты серологических реакций Инв. номер МРА с предлагаемым МРА со стандартным РА со стандартным антигеном единым антигеном антигеном 125 Изобретение относится к области ветеринарной бактериологии и иммунологии, и может быть использовано при серологической диагностике бруцеллза собак. Известен способ получения антигена для модификационной реакции агглютинации при диагностике бруцеллза КРС,включающий выращивание штамма бруцелл, обеззараживание полученной культуры клеток, центрифугирование с последующим отделением надосадочной жидкости и стабилизирование Предварительный патент Республики Казахстан 4572, кл. А 61 К 39/10, 1997. Недостатком указанного способа является низкая специфичность и активность в модификационной реакции агглютинации. Задачей изобретения является получение антигена из гладких и шероховатых видов бруцелл. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности, чувствительности и высокой активности в модификационной реакции агглютинации. Способ получения антигена для модификационной реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза собак,включающий выращивание штамма бруцелл, обеззараживание полученной культуры клеток, центрифугирование с последующим отделением надосадочной жидкости и стабилизирование, в качестве антигена используют штаммыВ-0267 иВ 0488, которые выращивают раздельно на эритрит агаре с добавками, полученную чистую культуру взвесей бруцелл каждого штамма смывают из пробирок стерильными физиологическими раствором, затем бактериальные суспензии каждого штамма бруцелл отдельно в концентрации 200 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллзному стандарту мутности центрифугируют трижды при 5000 об/мин в течение 30 мин, отмывают от примесей питательной среды, после чего бактериальные суспензии каждого из штаммов бруцелл доводят до 30 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности и подвергают разрушению мембраны штаммов бруцелл хлороформом, при этом хлороформ в течение 2 ч осаждают и удаляют, а два верхних слоя переносят раздельно в стерильные флаконы, затем оба антигена смешивают в равных объмах и титруют в модификационной реакции агглютинации с негативными и позитивными - и сыворотками крови и получают целевой продукт. Эритрит агар с добавками - питательная среда для матричной расплодки штаммов бруцелл, готовят по прописи 1000,0 см 3 дистиллированной воды,36,0 г сухого питательного агара с эритритом, 8,0 г агар-агара, 10,0 г глюкозы, 20,0 см 3 глицерина, 0,3 г-цистина, 0,2 см 3 дрожжевого экстракта Каталог культур микроорганизмов. - Алматы КазНИВИ,2005, 205. ШтаммыВ-0267 иВ-0488 используют для изготовления антигена при диагностике бруцеллза собак. Указанные штаммы депонированы в Лаборатории Национальной коллекции депонированных штаммов микроорганизмов Государственного учреждения Национальный центр мониторинга, референции, лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии Комитета государственной инспекции в агропромышленном комплексе Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан. Идентификацию штаммов бруцелл проводят по морфологическим, культуральным и физиологобиохимическим свойствам согласно определителя-, -, -,/, 2005. -.. . - 370 - 386 р. Штамм-0267 Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные, микрококки, диаметр 0,3 мкм,неподвижные, специализированные клетки не образуют. Культуральные свойства. На эритрит агаре с добавками вырастают янтарные, прозрачные в проходящем свете, выпуклые, круглые колонии,часть колоний неправильно контурированные. Колонии в- форме плотные, шероховатые и гладкие с металлическим оттенком. Накопление бакмассы наблюдается через 24-48 часов выращивания. В питательном бульоне образуют хлопчатый осадок с зоной просветления над осадком. Аэроб. Оптимальная температура выращивания 37 С при рН 6,8-7,2. Антигенная структура. Содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных дляв-форме. Патогенные свойства. Патогенен для морских свинок. Минимальная инфицирующая доза 100 м.т. Маркерные признаки штамма и методы их выявления Генетические - штамм находиться в-форме. Хорошо растет на средах с содержанием тионина в разведении 125000, 150 000, 1 100 000. Биохимические свойства - обладает каталазной активностью. Иммунохимические - штамм при серологической типизации агглютинируется с- бруцеллезной сывороткой, а с- бруцеллезной и моноспецифическими антимелитензисной и антиабортусной сыворотками дает негативную реакцию. Дополнительные сведения. ШтаммВ-0267 свободен от бактериальных, грибковых,микоплазменных и вирусных контаминантов. ШтаммВ-0488 Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные, овоиды, красные от 0,2-2,20,40,8 мкм, с округлыми концами, неподвижные,специализированные клетки не образуют. Культуральные свойства. На эритрит агаре с добавками вырастают прозрачные, янтарные в проходящем свете, выпуклые колонии, круглые с гладкими краями. Накопление бакмассы наблюдается через 24-48 часов выращивания. В питательном бульоне образуют равномерную муть с 3 пробирках на эритрит агаре с добавками, в промаркированные в соответствии с названием штаммов колбы Тартаковского на эритрит агар с добавками. Культуры бруцеллВ-0267 иВ-0488 по отдельности смывают физиологическим раствором в промаркированные флаконы. Затем бактериальные суспензии каждого штамма бруцелл, отдельно в концентрации 200 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллзному стандарту мутности, центрифугируют трижды при 5000 об/мин в течение 30 минут, отмывают от примесей питательной среды. После чего бактериальные суспензии каждого из штаммов бруцелл доводят до 30 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности и подвергают разрушению мембраны штаммов бруцелл хлороформом. Хлороформ в течение 2 ч осаждают и удаляют, а два верхних слоя переносят раздельно в стерильный флаконы, затем оба антигена смешивают в равных объемах и титруют в модификационной реакции агглютинации с негативными и позитивными - и сыворотками крови. Пример 2. Приготовленный антиген апробируют на специфичность и активность в классической реакции агглютинации (РА) и модификационной реакции агглютинации (МРА) в сравнении с единым бруцеллзным антигеном при исследовании сывороток крови приотарных собак,принадлежащих сельхозформированиям Алматинской области. Результаты активности и специфичности предлагаемого антигена в сравнении со стандартным единым бруцеллзным антигеном представлены в таблице. пристеночным кольцом голубоватого оттенка. Аэроб. Оптимальная температура выращивания 37 С при рН 6,8-7,2. Антигенная структура. Содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных дляв-форме. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Галота установлено, что штаммВ-0488 имеет слабую вирулентность. Маркерные признаки штамма и методы их выявления Генетические - растет на средах с пенициллином в дозе 75 ЕД/мл среды и на среде с фуксином и тионином в разведении 150000 1100000. Биохимические свойства - обладает уреазной,оксидазной и каталазной активностью. Иммунохимические - иммуноферментный анализ(ИФА), полимеразно-цепная реакция (ПЦР),реакция связывания комплемента ( К) в рабочем титре 15,штамм с монорецепторными антимелитензисной (1320) и антиабортусной (180) сыворотками дает позитивную реакцию. Дополнительные сведения. ШтаммВ-0488 свободен от бактериальных,грибковых,микоплазменных и вирусных контаминантов. Способ получения антигена для модификационнной реакции агглютинации при диагностике бруцеллза собак состоит в следующем. Пример 1. Матричную расплодку коллекционных штаммовВ-0267 иВ-0488 культивируют отдельно в пробирках на эритрит агаре с добавками. Бактериальную массу получают путем высева бульонной культуры бруцеллВ-0267 иВ-0488, вегетированных в Таблица Результаты испытаний активности и специфичности предлагаемого антигена в сравнении со стандартным единым бруцеллезным антигеном Результаты серологических реакций Инв. номер МРА с предлагаемым МРА со стандартным РА со стандартным антигеном единым антигеном антигеном 125 Из таблицы видно, что предлагаемый антиген обладает более высокой активностью и специфичностью по сравнению со стандартным антигеном. Использование предлагаемого антигена позволит наиболее точно выявить больных бруцеллзом собак с помощью постановки модификационной реакции агглютинации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для модификационной реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза собак, включающий выращивание штамма бруцелл, обеззараживание полученной культуры клеток, центрифугирование с последующим отделением надосадочной жидкости и стабилизирование, отличающийся тем, что в качестве антигена используют штаммы-0267 и-0488, которые выращивают раздельно на эритрит агаре с добавками, полученную чистую культуру взвесей бруцелл каждого штамма смывают из пробирок стерильным физиологическим раствором, затем бактериальные суспензии каждого штамма бруцелл отдельно в концентрации 200 млрд.микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности центрифугируют трижды при 5000 об/мин в течение 30 мин, отмывают от примесей питательной среды,после чего бактериальные суспензии каждого из штаммов бруцелл доводят до 30 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности и подвергают разрушению мембраны штаммов бруцелл хлороформом, при этом хлороформ в течение 2 ч осаждают и удаляют, а два верхних слоя переносят раздельно в стерильные флаконы, затем оба антигена смешивают в равных объемах и титруют в модификационной реакции агглютинации с негативными и позитивнымиисыворотками крови.