Способ получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных

(51) 61 39/10 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат достигается созданием способа получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных, который включает выращивание культуры бруцелл 19 на питательной среде, смывание,отмывание и суспендирование бруцелл,инактивацию бактериальной взвеси нагреванием и добавление красителя и буферного раствора,приготовленного на молочной кислоте, при этом отличительной особенностью является то, что после инактивации к бактериальной взвеси добавляют раствор метиленового голубого до концентрации 120000, выдерживают при комнатной температуре,шутелируют в течение 1 часа, окрашенную бакмассу центрифугируют при 3000 в течение 30 минут,надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют добавляя 0,2 формалинизированный физиологический раствор,который тщательно смешивают с равным объемом буферного раствора рН 3,7.(72) Мустафин Батыржан Муафикович Тен Виктор Борисович Мустафин Муафик Кометаевич Базарбаев Марат(56) Предварительный патент РК 10890, кл. А 61 39/00, 2001(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦВЕТНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ПЛАСТИНЧАТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Технический результат получение специфического антигена, обладающего высокой диагностической активностью и упрощение технологии его получения. Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Известен способ получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных, включающий выращивание культуры 19 на питательной среде с последующим смывом,отмывание и суспензирование бруцелл, инактивацию полученной бактериальной суспензии нагреванием и добавление красителя. Инактивацию бактериальной взвеси,приготовленной на карболинизированном физиологическом растворе,проводят при температуре 70-80 С в течение 2 ч. с последующим добавлением раствора катамина до 0,02 0,1-ной концентрации, затем взвесь выдерживают в термостате в течение 1 ч. Периодически встряхивая,полученную бакмассу окрашивают добавлением раствора красного 6 С до 0,1-0,2-ной концентрации и выдерживают при температуре 18 С, встряхивая в течение 2 ч., затем окрашенную бакмассу центрифугируют при 4000 в течение 30 мин,надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 карболинизированном физиологическом буферном растворе рН 3,65,приготовленном на молочной кислоте(Предварительный патент РК 10890, МПК А 61 К 39/00, - 2001). Недостатком способа является необходимость использования дорогостоящего красителя - раствора красного 6 С, а также сложность и трудоемкость получения целевого продукта. Задача изобретения - создание способа получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных. Технический результат получение специфического антигена, обладающего высокой диагностической активностью и упрощение технологии его получения. Технический результат достигается созданием способа получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных, который включает выращивание культуры бруцелл 19 на питательной среде, смывание,отмывание и суспендирование бруцелл,инактивацию бактериальной взвеси нагреванием и добавление красителя и буферного раствора,приготовленного на молочной кислоте, при этом отличительной особенностью является то, что после инактивации к бактериальной взвеси добавляют раствор метиленового голубого до концентрации 120000, выдерживают при комнатной температуре,шутелируют в течение 1 часа, окрашенную бакмассу центрифугируют при 3000 в течение 30 минут,надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют добавляя 0,2 формалинизированный физиологический раствор,который тщательно смешивают с равным объемом буферного раствора рН 3,7. 2 Анализ научной и патентной литературы аналогичных способов не выявил. Способ получения цветного антигена состоит в следующем Пример 1. 3-суточную культуру В. 19 смывают 0,2-ным формалинизированным 12 гипертоническим селеновым раствором. В взвеси определяют концентрацию бруцелл и готовят 100 млрд. взвесь с последующей инактивацией бакмассы на водяной бане при 70 С в течение 30 мин. Затем к взвеси добавляют раствор метиленового голубого до концентрации 120000, шутелируют при комнатной температуре 1 ч. Далее окрашенную взвесь центрифугируют при 3000 в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в таком же количестве формалинизированным физиологическим раствором, который тщательно смешивают с равным объемом буферного раствора с рН 3,7 приготовленного на молочной кислоте. Приготовленный антиген разливают в стерильных условиях во флаконы объемом 10,0-20,0 мл из нейтрального стекла, закупоривают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Активность цветного антигена определяют в лабораторных условиях. Пример 2. Пластинчатую реакцию агглютинации(ПРА) проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках с лунками при температуре плюс 18-30 С. На бортиках пластинки,против каждой лунки записывают номер испытуемой сыворотки. Методика постановки. Антиген готовили по следующей методике 5-15 генцианвиолет 150000 или метиленовый голубой 120000 или бриллиантовый зеленый 120000. Смесь выдерживают при комнатной температуре 5-6 дней после чего антиген можно использовать для реакции. Результаты проведенной работы представлены в таблице 1. Смешивают стеклянной палочкой, прогревают над пламенем спиртовки до -37-40 С в течение 5 минут. Взаимодействие антигена и антитела в количестве 0,01, 0,02 считается положительной, при взаимодействии антигена и антитела в количестве 0,04 считается сомнительной реакцией. В случае отсутствия взаимодействия антигена и антитела в количестве 0,01, 0,02, 0,04 - считается отрицательной. Идентичные показания проявляются с цельной каплей крови. Ускоренная реакция(РА) на стекле. Преимущество ее состоит в том, что для постановки реакции требуется небольшое количество антигена и ее можно ставить непосредственно в условиях производства. При этом для постановки не требуется термостатов, в которых длительное время выдерживают 18-20 часов комплекс состоящий из антигена, антитела, причем антитело разводят при помощи физраствора до определенных разведений(150, 1100, 1200, 1400). Все сыворотки,с которыми получена положительная ПРА, в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК, РДСК (реакция связывания комплемента) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител. РА и РСК (РДСК) проводят согласно наставлениям по их постановке и учету. Сыворотки, с которыми получена отрицательная ПРА, дополнительно в РА и РСК (РДСК) не исследуют. Диагностическую оценку испытуемых сывороток проводят по схеме, представленной в таблице 2. В заключении лаборатории о результатах исследований сообщают диагностическую оценку(положительная, сомнительная, отрицательная) и указывают показания всех реакций. Например положительная (ПРА, РА 200 МЕ, РСК),сомнительная (ПРА, РА-, РСК-). При диагностической оценке сомнительная,сыворотку крови данного животного повторно исследуют через 15-30 дней в ПРА, РА, РСК(РДСК). В случае положительного или вторичного сомнительного результата при повторном исследовании сывороток крови диагностическая оценка считается положительной. При получении положительного результата исследований крови у отдельных по бруцеллезу хозяйствах поступают в порядке, предусмотренном пунктом 5 действующей инструкции о мероприятиях и профилактике по ликвидации бруцеллеза животных. При изучении диагностической ценности изготовленного нами цветного антигена в сравнении с биофабричным РБП(розбенгалпроба) подвергнуты исследованию поливалентные сыворотки против салмонелл, лептоспир, пастерелл,энтерококка,кампилобактерий(вибрио-фетус венериалис,вибро-фетус интестиналис,вибриобубулис). При этом во всех случаях был отрицательный результат, что свидетельствует о специфичности приготовленных диагностикумов. Затем исследовали сыворотки крови различных по эпизоотологической характеристике групп сельскохозяйственных животных. Полученные данные отражены в таблице 3. Как видно из данных таблицы,все благополучные по бруцеллезу группы животных имели отрицательные показания по всем серологическим тестам, а в неблагополучных хозяйствах наблюдается выделение реагирующих на бруцеллез, процентное соотношение зависит от пораженности стада. Предложенный способ обеспечивает получение специфического антигена, обладающего высокой диагностической активностью. Таблица 1 Сыворотка положительнаяантиген неразведенный Сыворотка отрицательнаяантиген неразведенный Сыворотка положительная испытуемая 0,04 Схема постановки реакции Количество компонентов, результаты реакции 0,02 0,01 Схема диагностической оценки испытываемых сывороток Показания реакций РА РСК (РСДК) Положит. Сомнител. Положит. Отрицат. Сомнител. Положит. Сомнител. Сомнител. Сомнител. Отрицат. Отрицат. Положит. Отрицат. Сомнител. Отрицат. Отрицат. Не исслед. Не исслед. Результаты исследований сывороток крови сельскохозяйственных животных. Вид животных (по Эпизоотические характеристики К-во Позитивные показания половозрастным РА РСК РПБ группам) биоф. Крупный рогатый скот Неблагополучный гурт через 6 37 16 12 21 мес. после вакцинации шт. 82 Мелкий рогатый скот Благополучный 12 Верблюды взрослые Благополучный гурт 20 невакцинированный Верблюды взрослые Благополучный гурт 56 9 13 17 невакцинированный Крупный рогатый скот Благополучный гурт через 6 мес. 61 после вакцинации препаратом стимул, иммунитет к бруцеллезу живота. Мелкий рогатый скот Неблагополучное стадо 44 5 11 15 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения цветного антигена для постановки пластинчатой реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных,включающий выращивание культуры бруцелл 19 на питательной среде, смывание,отмывание и суспендирование бруцелл,инактивацию бактериальной взвеси нагреванием,добавление красителя и буферного раствора, приготовленного на молочной кислоте,отличающийся тем, что после инактивации к бактериальной взвеси добавляют раствор метиленового голубого до концентрации 120000,выдерживают при комнатной температуре,шутелируют в течение 1 часа, окрашенную бакмассу центрифугируют при 3000 в течение 30 минут,надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,2 формалинизированном физиологическом буферном растворе рН 3,7.