Способ диагностики гриппа лошадей с помощью прямого “сэндвич”- варианта твердофазного иммуноферментного анализа

(51) 61 39/145 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ лабораторной диагностики и типирования вируса гриппа лошадей в различных клинических образцах с помощью прямого сэндвичварианта иммуноферментного анализа (ИФА). Предложен способ ИФА для обнаружения антигена ВГЛ, где в качестве первого слоя сэндвича и в качестве улавливающих антител используются моноспецифические поликлональные антитела к РНП ВГЛ. Изобретение предназначено для лабораторной диагностики и типирования вируса гриппа лошадей. Проводят сорбцию иммуноглобулина к РНП ВГЛ на твердую фазу, отмывание избытка белка раствором,содержащим твин-80. Затем проводят контактирование глобулина с испытуемыми антигенами, а затем с конъюгатом РНП- антител с пероксидазой хрена, добавляют субстрат и после инкубации регистрируют интенсивность окрашивания смеси. Разработанный способ постановки ИФА,основанный на использовании поликлональных антител против РНП, пригоден для выявления вируса гриппа А лошадей в любых клинических образцах. Полученные данные положительно коррелировали с результатами тест-системыА и с результатами ОТ-ПЦР.(72) Матвеева Валентина Михайловна Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Сансызбай Абылай Рысбайулы Сейсенбаева Мадина Сагадатовна Корягина Марина Ивановна Нурабаев Сергазы Шуратбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ЛОШАДЕЙ С ПОМОЩЬЮ ПРЯМОГО СЭНДВИЧ- ВАРИАНТА ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно, к методам диагностики и идентификации вирусных инфекций и представляет собой способ Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно, к методам диагностики и идентификации вирусных инфекций и представляет собой способ лабораторной диагностики и типирования вируса гриппа лошадей (ВГЛ) в различных клинических образцах с помощью прямого сэндвич- варианта иммуноферментного анализа (ИФА). Из существующих методов диагностики, ИФА является высокочувствительным, специфичным и экспрессным методом диагностики многих вирусных заболеваний. К достоинствам ИФА также относится возможность автоматизации процессов постановки реакции и одновременное исследование большого количества проб, стандартизация учта проб в полевых условиях и компьютерная обработка результатов. Уровень техники. Известен ряд способов выявления вирусов гриппа, например, в реакции гемагглютинации,с помощью реакции иммунодиффузии,при использовании иммунофлюоресценции или радиоиммунологического анализа. Наиболее широкое применение получил ИФА благодаря своей высокой чувствительности, специфичности и простоте технического исполнения. Известен способ проведения точечного ТФ-ИФА вирусных антигенов и антител (Патент США 4774177, кл. 01 33/53 33/544, кл. 435-7, опубл. 27.09.88), который используется для диагностики вируса гриппа и вируса псевдочумы (Ньюкасолской болезни) птиц. Способ включает получение образцов сыворотки крови, содержащих антиген определяемого вируса, а также специфичных связывающих антител к определяемому вирусу и вторых антител - конъюгата белка А с пероксидазой хрена. Антиген(АГ) прикрепляют к нитроцеллюлозной подложке и последовательно обрабатывают эту подложку с АГ первыми и вторыми антителами, инкубируют и промывают в буферном растворе с последующим окрашиванием иммунохимического комплекса хромогеном. По появлению цветных пятен на подложке в месте нанесения положительных образцов судят о наличии антигена в пробе. К недостаткам способа относят недостаточную специфичность определения антигена вируса в исследуемой пробе (т.к. образец представляет собой сыворотку крови). Известен способ выявления вируса гриппа(Патент 2055365, кл. 01 33/53, опубл. 27.02.1996), который используется для обнаружения данного вируса. Способ сводится к следующему. Вирусную суспензию вносят в лунки иммунологических планшет и инкубируют в течение ночи. Затем планшеты 3 раза промывают буфером для отмывки, содержащим 99,995 забуференного раствора 7,3 и 0,005 дезинтегрона-0. После этого в лунки вносят пероксидазный конъюгат антител к антигену вируса гриппа, разведенный в упомянутом буфере. Через 1 ч инкубации при 37 С лунки опорожняют, отмывают,как описано выше, и заполняют раствором 2 субстрата к пероксидазе хрена. Результаты реакции учитывают по интенсивности окрашивания растворов в лунках. Наиболее близким к предлагаемому способу обнаружения антигенов ВГЛ является метод антигенсвязывающего ИФА(2011),10.1016/ 2011.04.01610),предназначенный для быстрого обнаружения рибонуклеопротеида (РНП) вируса гриппа лошадей. Метод основан на использовании моноклональных антител против РНП ВГЛ, как наиболее консервативного белка, способного выявлять общие антигенные детерминанты этого вируса, в прямом сэндвич - ИФА. Результаты ИФА сравнивали с тестом гемагглютинации и -. Было установлено, что АС-ИФА может обнаружить вирус в носовых образцах уже на 3 день после заражения у экспериментальных животных,также эти результаты подтверждаются на 100 с результатами- и выделением вируса. Недостатком данного метода является высокая стоимость проведения анализа с использованием моноклональных антител,что ограничивает область его применения. Предлагаемое изобретение по сравнению с другими способами основано на использовании поликлональных антител против РНП ВГЛ в прямом сэндвич - ИФА, так как их применение повышает чувствительность теста, что подтверждали (, ., -, ., , .. // . .1987.,. // .. 2004) и снижает себестоимость метода. Проведенный заявителем анализ уровня техники,включающий поиск по патентным и научнотехническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить,что заявитель не обнаружил источники,характеризующиеся признаками, тождественными(идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Поисковые исследования прототипа,как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить отсутствие такового. Следовательно,заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности новизна. Для проверки соответствия предлагаемых решений условию патентоспособности изобретательский уровень проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствуют условию патентоспособности изобретательский уровень. Сущность изобретения. Изобретение предназначено для лабораторной диагностики и типирования вируса гриппа лошадей. Проводят сорбцию иммуноглобулина к РНП ВГЛ на твердую фазу, отмывание избытка белка раствором,содержащим твин-80. Затем проводят инкубирование иммуноглобулина с испытуемыми антигенами, а затем с коньюгатом РНП-антител с пероксидазой хрена, добавляют субстрат и после инкубации регистрируют интенсивность окрашивания смеси. Задача изобретения. Разработка эффективного ИФА на основе иммуноглобулина к РНП ВГЛ с целью обнаружения типоспецифического антигена данного вируса в любых клинических образцах. Техническим результатом изобретения является разработка чувствительного и специфичного способа постановки ИФА, основанного на использовании поликлональных антител против РНП вируса, пригодного для выявления вируса гриппа лошадей в любых клинических образцах. Способ выполняется следующим образом. В лунки полистироловых плоскодонных плашек вносят специфический иммуноглобулин к РНП ВГЛ в концентрации 13 мкг/см 3 в 0,01 М КББ, с 9,6. Планшет выдерживают в течение 16-18 ч при(42)С. Затем планшет трижды промывают раствором для ИФА и вносят в качестве наполнителя 1 раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в каждую лунку и инкубируют при (371)С в термостате в течение 1 ч. Затем содержимое лунок удаляют, плашку однократно промывают раствором для ИФА (ФБСТ), подсушивают и хранят до использования при -(153)С не более одной недели. Готовят разведения контрольных и испытуемых проб антигенов (как указано на схеме) в растворе для ИФА и разливают по 0,1 см 3 в один ряд лунок плашки (по горизонтали). Примерная схема постановки ИФА по выявлению антигена ВГЛ 1 Раствор для ИФА 2 Нормальный 6 Испытуемый 3 Примечания 1. - положительный результат (синее окрашивание) 2., отрицательный результат (слабо-голубое окрашивание или окрашивания нет). Пластину с нанесенными на нее пробами инкубируют в течение 2 ч при (371)С. Затем пятикратно промывают раствором ФБСТ. После промывки и просушивания планшета в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 рабочего разведения пероксидазного конъюгата РНП - антител ВГЛ в растворе ФБСТ. Плашку с конъюгатом инкубируют в термостате при (371)С в течение 1 ч, пятикратно промывают вышеупомянутым раствором для ТФИФА и вносят по 0,1 см 3 рабочего раствора субстрата для пероксидазы (АБТС). Результаты реакции учитывают через 30-60 мин. Учет результатов ИФА проводят визуально или на фотометре марки Мультискан. При визуальном учете реакции титром антигена считают его предельное разведение, в котором он связывается со специфическим иммуноглобулином,иммобилизированным на твердой фазе (в лунках пластин) и вызывает окисление субстрата(развивается синее окрашивание). При этом интенсивность окрашивания должна уменьшаться с разведением антигена. В лунках, обработанных отрицательным антигеном(контроль специфичности),допускается слабо-голубое окрашивание,исчезающее до разведения диагностикума 110. При учете результатов реакции 3 на фотометре марки Мультискан при длине волны 405 нм, для АБТС, результаты считают положительными, если оптическая плотность специфического антигена в 2 и более, раз превышает оптическую плотность контрольного(нормального) антигена. Разработанный способ постановки ИФА,основанный на использовании поликлональных антител против РНП, пригоден для выявления вируса гриппа А лошадей в любых клинических образцах. Полученные данные положительно коррелировали с результатами тест-системыА и с результатами ОТ-ПЦР. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики гриппа лошадей с помощью прямого сэндвич- варианта твердофазного иммуноферментного анализа,включающий выявление общего типоспецифического антигена вируса гриппа лошадей в клинических образцах в течение 5 часов после поступления биоматериала,отличающийся тем, что при разработке ИФА используют поликлональный иммуноглобулин к РНП белку вируса гриппа лошадей, в концентрации 13 мкг/см 3, и конъюгата РНП-антител, меченных пероксидазой хрена по методуи .