Способ получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей из рекомбинантного холодоадаптированного штамма

(51) 61 39/145 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ рекомбинантный холодоадаптированный штамм///62/2010, полученный методом обратной генетики в НИИПББ НЦБМОН РК,культивируемый на куриных эмбрионах, с последующим введением комплексной стабилизирующей среды и для повышения иммуногенности вакцины добавляется адъювантолигосахарид хитозана. Изобретение обеспечивает получение эффективной живой интраназальной вакцины для профилактики гриппам лошадей, с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более технологичным и экономичным. Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает заражение куриных эмбрионов рекомбинантным холодоадаптированным штаммом вируса гриппа,сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости,введение стабилизатора и адъюванта, розлив в ампулы и лиофилизацию. При этом стабилизатор содержит навески из пептона и лактозы, а в качестве адъюванта используется 0,05 олигосахарид хитозана. Полученная вакцина содержит высокоактивный вирус из рекомбинантного холодоадаптированного штамма, предназначенный для интраназального введения, что снижает возможность возникновения аллергических реакций и возможность репродукции вируса в нижних дыхательных путях лошадей, и процесс ее изготовления является более технологичным и экономичным.(72) Кыдырбаев Жайлаубай Кыдырбаевич Табынов Кайсар Казыбаевич Сансызбай Абылай Рысбайулы Асанжанова Нурика Нарынбековна Рыскельдинова Шолпан Жанбырбаевна Кожамкулов Еркен Муратханович Инкарбеков Дулат Амангелдиевич Гоцкина Татьяна Михайловна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГРИППА ЛОШАДЕЙ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ХОЛОДОАДАПТИРОВАННОГО ШТАММА(57) Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и представляет собой способ получения живой интраназальной вакцины против гриппа /38 из рекомбинантного штамма///62/2010,полученного методом классической генетики в НИИПББ КН МОН РК для разработки эффективной вакцины против гриппа лошадей. Сущность изобретения заключается в том, что для получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей используется новый Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и представляет собой способ получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей /38 из рекомбинантного штамма ///62/2010. В мировой практике для профилактики гриппа лошадей преимущественно используются инактивированные вакцины,существенным недостатком которых является то, что они формируют у привитых животных исключительно гуморальный иммунитет, обладающий низкими возможностями перекрестной защиты от гетерогенных или генетически отдаленных полевых вирусов. Из-за их низкой иммуногенности и продолжительности создаваемого ими иммунитета,производители вынуждены периодически обновлять штаммовый состав вакцин на более актуальные производственные вирусы, включать в состав вакцин дорогостоящие адъюванты, увеличивать кратность иммунизации животных, что неминуемо ведет к возрастанию стоимости профилактической иммунизации лошадей. Кроме того, некоторые инактивированные вакцины с масляными адъювантами обладают высокой реактогенностью у привитых животных, вызывая воспалительные реакции на месте введения препарата. Общая практика показывает, что в большинстве стран после ревакцинации лошадей прививают через каждые 6 месяцев. Иммунитет,стимулируемый инактивированными вакцинами, зависит, прежде всего, от индукции антител к гемагглютинину и такие вакцины вызывают защиту, хорошо коррелирующую с уровнем циркулирующих антител к гемагглютинину. В отличие от этого иммунитет, вызванный инфекцией или прививкой живой аттенуированной вакциной, не зависит от присутствия циркулирующего антитела, и вероятно,способствует мукозальным и клеточным ответам. Таким образом, существует потребность в разработке вакцины,способной выработать длительный иммунитет вне зависимости от штаммовых изменений вируса гриппа лошадей, и также эффективной для прививки через слизистую оболочку, что является удобным способом вакцинации. Известен способ получения вакцины из реассортантного штамма,полученного в Департаменте медицинской микробиологии (,Калифорния, США) из эпидемического вируса/2//79) и высокорепродуктивного штамма //8/34 (11). Согласно указанному способу аттенуированный вирус получили методом генетической реассортации, который содержит поверхностные антигены эпидемического вируса/2//79) и 7 сегмент высокорепродуктивного штамма //8/34 (11). При этом проводили трехкратное клонирование родительских вирусов на 10-суточных куриных эмбрионах в течение 48 часов раздельно,полученные аллантоисные жидкости (АЖ) в 2 дальнейшем клонировали вместе при 37 С в течение 24 часов и собирали. В дальнейшем наработанный ре- ассортант был приспособлен к росту в культуре клеток, в частности, в культуре клетоксерией последовательных пассажей. Приготовленная по вышеизложенному способу вакцина при двукратном применении в прививочной дозе с интервалом в 21 неделю формировала у лошадей иммунитет напряженностью титров антител в реакции торможении гемагглютинации(РТГА) с гомологичным антигеном от 1192 до 1384 на 28 неделе постпрививки Патент США. 6045790, . 4, 2000, ,. Существенным недостатком способа является низкая производительность использованной биосистемы для культивирования, так как в культуре клеток вирусы гриппа плохо размножаются и соответственно иммуногенность полученной вакцины невысока, поэтому необходима двукратная прививка,что увеличивает себестоимость вакцины. Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является разработанная в корпорации(США) технология изготовления первой модифицированной живой интраназальной вакцины против гриппа ( ,) из холодоадаптированного дикого штамма///1/91. В естественных условияхштаммы вируса гриппа лошадей эффективно репродуцируются в верхних дыхательных путях, где они вызывают местные и системные иммунные ответы. Наиболее значимое преимущество этого штамма заключается в том, что он не способен размножаться при высоких температурах в нижних дыхательных путях, где репликация дикого вируса обычно сопровождается развитием бронхита,пневмонии и отека легких. Указанное свойство этого штамма рассматривается как ключевой фактор,исключающий генерализацию инфекционного процесса, ввиду невозможности репликации вируса при нормальной температуре тела лошадей Патент США. 7438919 В 2.21,2008, . . Наиболее значимым недостатком представленного метода является используемая в качестве биосистемы для культивирования культура клеток, в которой накопление вируса наблюдается в низких титрах, что является неэкономичным и увеличивает расходы на производственный процесс. Сущность изобретения состоит в том, что с применением оптимальной биосистемы для культивирования, а именно 10-11 суточных куриных эмбрионов нарабатывается высокоактивная вируссодержащая аллантоисная жидкость (ВАЖ),где в качестве вакцинного штамма используется новый рекомбинантный холодоадаптированный шгамм ///62/2010, полученный в НИИПББ КН МОН РК методом классической генетики, в дальнейшем ВАЖ с применением оптимальных стабилизаторов и добавлением адъюванта,лиофилизируется и запаивается в ампулы. Задачей изобретения является разработка способа получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей /38. В основу настоящего изобретения положена задача расширения технологических возможностей за счет использования оптимальной системы культивирования- куриных эмбрионов, с использованием нового холодоадаптированного штамма вируса гриппа, при этом не применяются методы глубокой очистки и концентрирования вируса, что улучшает технологичность процесса получения вакцины, используются комплексная стабилизирующая среда и адъювант, и в целом наблюдается повышение экономической эффективности полученного таким способом вакцины, безопасности и иммуногенности за счет интраназального метода введения вакцины. Технологии получения живых аттенуированных вакцин на основе холодоадаптированных штаммов просты и высокопроизводительны, не требуют больших материальных и трудовых затрат. При оптимизации параметров культивирования холодоадаптированного штамма можно с одного куриного эмбриона получать вирусную биомассу,достаточную для приготовления 50-100 доз вакцины, в то время как при получении только одной дозы инактивированной вакцины требуется 1-2 эмбриона. Техническим результатом предложенного способа является получение живой вакцины для профилактики гриппа вводимого интраназально,исключающего вероятность проявления аллергических реакций на балластные белки вируссодержащей аллантоисной жидкости у лошадей, с более высокой безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является более высокопроизводительным и экономичным. Технический результат достигается за счет а) наработки вируссодержащей суспензии на куриных эмбрионах 10-11 суточного возраста б) использования рекомбинантного штамма///62/2010, полученного в НИИПББ КН МОН РК методом классической генетики из эпизоотического вируса(38) и донора аттенуации штамма //1/68/35 (32). Вакцинный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов НИИПББ КН МОН РК под 04-12/ от 03.09.2012 и имеет паспорт международного образца,позволяющий его использовать для приготовления вакцины против гриппа лошадей /38 в) использования в качестве стабилизаторов пептона и лактозы в конечной концентрации 6 и 3, соответственно г) добавления адъюванта - олигосахарида хитозана в конечной концентрации 0,05 д) лиофилизации с предварительным охлаждением до температуры не выше минус 45 С. Процесс сушки идет при температуре конденсатора не выше минус 52 С, конечная температура материала 18-22 С поддерживается в течение 10 12 ч. Ампулы с высушенным ВЖ запаивают на карусельно-коллекторном аппарате при остаточном давлении от 25 до 30 Па. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления, который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения, при рассмотрении представленного здесь описания. Способ получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей /38 осуществляется следующим образом 1. Получение ВАЖ 1.1. Приготовление рабочего разведения посевного материала. Работу проводят в асептических условиях. Ампулу сухого маточного материала вскрывают согласно правилам и растворяют содержимое в 1 мл физиологического раствора ( 7,20,2) и разводят в зависимости от биологической активности вируса до 100000 ЭИД 50/0,2 мл. 1.2. Заражение эмбрионов Эмбрионы в лотках подаются в предбокс, где производится обработка скорлупы обжигом горящим спиртовым факелом. Обработанные эмбрионы передают в бокс. Металлическим пробойником, предварительно обработанным 96 спиртом и обожженным в огне, в скорлупе на тупом конце яйца над воздушной камерой делают прокол. Через полученное отверстие с помощью шприцадозатора иглой 26 в каждый эмбрион вводят по 0,2 мл посевного материала. После парафинирования лотки с зараженными эмбрионами поступают в термальные комнаты. 1.3. Инкубация эмбрионов Куриные эмбрионы,зараженные рекомбинантным вирусом гриппа типа А инкубируют в течение 48 часов при температуре плюс 32 С и влажности 605 в термальной комнате. Погибшие в первые 24 часа эмбрионы отбраковывают как неспецифическую гибель и утилизируют после автоклавирования. Охлаждение оставшихся эмбрионов через 48 часов инкубирования осуществляют в течение 182 часа при температуре плюс 4 2 С. 1.4. Сбор ВАЖ Работу проводят в асептических условиях. Поверхность скорлупы эмбрионов обрабатывают горящим спиртовым факелом. Пинцетом,обработанным 96 спиртом и обожженным в пламени, снимают часть скорлупы над воздушным мешком и стерильной пипеткой прокалывают хорионаллантоисную оболочку. Сбор ВАЖ осуществляют в стерильные пронумерованные флаконы (объем флаконов 0,5 литра). Из каждого флакона делают посев на 3 стерильность и берут выемки для получения объединенной пробы, которую контролируют на подлинность,специфическую активность,гемагглютинирующую активность. ВАЖ, прошедшую контроли (стерильную,подлинную, имеющую инфекционную активность не менее 107,5 ЭИД 50/0,2 мл), берут в работу. 2. Приготовление готового препарата 2.1. Приготовление защитной среды Для приготовления 0,8 литра стабилизатора берут навески пептон - 120 г, лактоза - 60 г, и отдельно каждую навеску растворяют в 0,4 л стерильной дистиллированной воды, объединяют и автоклавируют. Стабилизатор хранят при температуре плюс 2-8 С не более 1 месяца. 2.2 Приготовление адъюванта Для приготовления 0,2 л адъюванта берут навеску 10 г лактата олигосахарида хитозана и доводят до 0,2 л и автоклавируют. 2.3 Объединение ВАЖ с защитной средой и адъювантом. Приготовленный как указано выше стабилизатор, перед работой объединяют с адъювантом, доведя объем до 1,0 л, затем эту смесь в соотношении 11 добавляем к 1 л ВАЖ, при этом конечная концентрация пептона составляет 6,лактозы - 3, хитозана - 0,05. 2.4 Розлив полуфабриката вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой Работу проводят в асептических условиях. Перед началом работы проводят санитарную обработку боксов,а также контроль бактериальной обсемененности воздуха в рабочем помещении и рук персонала. Розлив вакцины осуществляется с помощью автоматического дозатора. Полученную смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные ампулы по 2 мл. Ампулы с вирусным материалом накрывают стерильной марлевой салфеткой (3 слоя) и в металлических кассетах хранят при температуре (31)С не более 810 ч. Во время розлива бутыль с вакциной периодически перемешивают. По мере заполнения кассет ампулы с вакциной отправляют в цех сушки. 3. Лиофилизация В цехе сушки кассеты с ампулами, содержащими вирусный материал, предварительно охлаждают до температуры не выше минус 45 С и помещают в камеру сублимационной установки с охлажденным до минус 5560 С конденсатором. Значение вакуума в период сублимации и досушивания колеблется в пределах 4-7 Па. Процесс сушки идет при температуре конденсатора не выше минус 52 С. Далее в течение 10-12 часов проводят досушивание вакцины при температуре плюс 2022 С. Ампулы с высушенным вирусом запаивают на карусельно-коллекторном аппарате при остаточном давлении от 25 до 30 Па. Анализ полученных соединений и их специфических свойств осуществляли с использованием электронной микроскопии, что позволило оценить наличие взвеси вирионов в достаточно высокой концентрации, структурно 4 морфологическую характеристику вакцинного препарата. Доля целых (неразрушенных) частиц составляет более 95, что свидетельствует о сохранности вирионов. В вакцине нативная антигенная структура вирусных частиц сохраняется. Живая вакцина из рекомбинантного штамма является жидкой формой и предназначена для интраназального введения. Вводимое количество зависит от подвергаемого профилактике субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, и если необходимо,продуцировать клеточноопосредованный иммунный ответ. Подходящие схемы первоначального введения и доз для ревакцинации могут варьировать, но могут включать первоначальную вакцинацию, за которой следуют последующие введения. Доза может также зависеть от пути введения, и будет варьировать в соответствии с размерами хозяина. Оценка безопасности,иммуногенных и протективных свойств полученного соединения проводилась путем исследования реакции иммунной системы и организма в целом на экспериментальных животных. Изобретение выполнимо в условиях научнопроизводственных объединений при наличии рекомбинантного штамма///62/2010 вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдении предлагаемого режима приготовления вакцины. Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения живой интраназальной вакцины против гриппа лошадей/38 из рекомбинантного холодоадаптированного штамма ///62/2010 вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех экспериментальных серий препарата в НИИПББ КН МОН РК, в последующем прошедших с положительными результатами комиссионные испытания специфической активности и безопасности вакцины, которые выполнялись в условиях Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности КН МОН РК(пгт. Гвардейский) с использованием лабораторных животных моделей (мыши и морские свинки) и лошадей, в соответствии с рекомендациями Международного эпизоотического бюро (МЭБ). Примеры использования предложенного способа Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, при этом примеры приведены лишь для иллюстрации, и не имеют в виду ограничение объема иллюстрации. Предполагаются изменения формы и замена элементов на эквиваленты, когда обстоятельства могут предполагать или увеличивать целесообразность. Хотя здесь были использованы специфические термины, они были использованы для целей описания, но не для целей ограничения изобретения. Пример 1 Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости 210 штук 10-сут куриных эмбрионов были заражены маточным материалом штамма///62/2010. После инкубирования в термальной комнате в течение 48 часов при температуре плюс 32 С и охлаждения в течение 18 часов в холодильной камере при температуре плюс 4 С была получена ВАЖ в количестве одного литра со специфической активностью вируса гриппа 8,7 ЭИД 50/0,2 мл. Получение готового препарата Приготовлено 0,8 л стабилизатора из навесок пептона - 120 г и лактозы - 6 г на дистиллированной воде, который затем был стерилизован двукратным автоклавированием с интервалом 18-20 часов при плюс 100 С в течение 20 минут. Стабилизатор объединен с 10 г лактата олигосахарида хитозана,растворенного в 0,2 л дистиллированной воды. Стабилизатор с адъювантом добавлен в бутыль с ВАЖ в соотношении 11, после чего раствор тщательно перемешан. Полуфабрикат вакцины был разлит в 2000 ампул по 1,0 мл в каждую. Ампулы с вирусным материалом накрывали стерильной тканевой салфеткой и переносили в цех лиофильной сушки. Лиофилизация была осуществлена согласно разработанному графику сушки. После окончания процесса высушивания ампул кассеты с ампулами направлены на запайку. Выход готового препарата составил 2000 доз вакцины. Пример 2 Сравнительная характеристика снижения специфической активности живой гриппозной вакцины в процессе лиофилизации при использовании предложенного стабилизатора и 1 желатина, 3 сахарозы, обезжиренного молока. ВАЖ, объединенные с 1 раствором желатина,или 3 сахарозой, или обезжиренным молоком, и ВАЖ,объединенная с предложенным стабилизатором, разливалась в ампулы в объеме 1,0 мл. После высушивания препаратов производили определение специфической активности, для этого содержимое обоих типов ампул растворяли в одинаковом объеме -1,0 мл. Методика определения специфической активности вируса гриппа на куриных эмбрионах. Определение проводили на развивающихся куриных эмбрионах 10-11-дневного возраста. Десятикратные разведения вируса готовили в 4,5 мл физиологического раствора с 7,0-7,4, меняя при каждом разведении пипетку. 0,2 мл ВАЖ из разведений от 10-6 до 10-10 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой специфической активности вируса) вводили в аллантоисную полость, используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов использовали один шприц, начиная с большего разведения. Эмбрионы инкубировали в течение 48 ч. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отобрали по 50 мкл аллантоисной жидкости, которую поместили в отдельные лунки плексигласовой панели. Затем в каждую лунку добавили по 50 мкл 1-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30-40 минут контакта при температуре плюс 202 С, после оседания эритроцитов в контроле,провели учет гемагглютинации. Контроль проводили, как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносили по 50 мкл физиологического раствора с 7,20,2. Вычисление инфекционного титра проводили по методу Рида и Менча. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Сравнительная инфекционная активность вакцины в процессе лиофилизации с различными стабилизирующими средами Стабилизатор Вакцина с предложенным стабилизатором Вакцина с желатином 1 Вакцина с сахарозой 3 Вакцина с обезжиренным молоком Из представленных данных следует, что одна доза вакцины, приготовленная с использованием предложенного стабилизатора,в процессе лиофилизации снижает инфекционную активность всего лишь на 0,25 ЭИД 50/мл, тогда как при использовании в качестве стабилизирующих сред 1 желатина идет снижение на 0,75 ЭИД 50/мл, 3 сахарозы или обезжиренного молока - 0,67 наЭИД 50/мл. Таким образом, предложенный стабилизатор является более эффективным для сохранения биологических титров вирусов гриппа по сравнению с желатином, сахарозой или обезжиренным молоком, и соответственно, гораздо более экономичным. Инфекционная активность ЭИД 50/мл До сушки После сушки 8,700,14 8,450,14 8,700,14 7,950,22 8,700,14 8,030,08 8,700,14 8,030,30 Пример 3 Сравнительная характеристика термостабильности стабилизаторов. Вышеуказанные типы вакцины с различными стабилизирующими средами (1 желатином, 3 сахарозой,обезжиренным молоком и предложенным стабилизатором) инкубировались в течение 10 и 20 суток при температуре плюс 37 С. В качестве контроля были использованы ампулы с ВАЖ без защитной среды. Методика определения специфической активности вируса гриппа приведена в примере 2. Результаты тестирования представлены в таблице 2. 5 Таблица 2 Сохраняемость вакцины против вируса гриппа лошадей с различными защитными средами при температуре 37 С Стабилизирующие среды Пептон (6) с лактозой (3) Желатин (1) Сахароза (3) Обезжиренное молоко Без защитной среды (контроль) Из представленных данных следует, что вакцина,приготовленная с предложенным стабилизатором,более термостабильна - снижение инфекционной активности через 20 сут при 37 С не более 2,42 ЭИД 50/мл, чем вакцина, приготовленная с желатином 4,5 ЭИД 50/мл, сахарозой - 5,0 ЭИД 50/мл или обезжиренным молоком - 4,5 ЭИД 50/мл, соответственно. Таким образом,использование нового рекомбинантного холодоадаптированного штамма,предложенного стабилизатора и специального режима лиофилизации позволяет получать живую вакцину против гриппа лошадей с максимальным сохранением инфекционных титров вируса. Пример 4 Изучение безопасности вакцины на модели мышей и морских свинок Были использованы мыши весом 15-22 г и морские свинки весом 500-600 г, обоего пола. Животные распределялись по группам случайным образом. Животных содержали на стандартном вскармливании, в качестве питьевой воды давали питьевую воду но ГОСТ 6709-72 и содержали раздельно по группам в специализированных клетках вивария, оснащенного приточно-вытяжной вентиляцией, с контролем температуры и влажности внутри комнат. Из животных каждого вида были сформированы группы по 5 особей в каждой. Лабораторным животным вводили интраназально вакцину,содержащую рекомбинантный холодоадаптированный штамм ///62/2010(38) вируса гриппа, приготовленную как указано в примере 1, после предварительного усыпления под эфирным наркозом. За опытными (группа 1 получившие вакцину с хитозаном, группа 2 получившие вакцину без хитозана, по 5 голов) и контрольной (группа 3 - 5 голов) группами мышей и морских свинок проводили клиническое наблюдение один раз в сутки до начала введения препаратов и в последующем ежедневно в течение 14 суток с ежедневным измерением массы тела животных. Токсичность оценивали по гибели,измерению массы тела животных, а также возможным клиническим симптомам интоксикации. При этом установлена хорошая переносимость и безвредность живой вакцины из холодоадаптированного штамма ///62/2010(38), так как в течение всего срока исследования мыши и морские свинки не погибали, не теряли в 6 весе и не проявляли клинических признаков интоксикации. Пример 5 Изучение иммуногенности живой интраназальной вакцины на морских свинках Эксперименты проводили на здоровых и серонегативных к вирусу гриппа морских свинках массой 350-450 г возраста 6-8 недель. Морские свинки были привиты двукратно приготовленной по примеру 1 вакциной в объеме 100 мкл в каждый носовой проход (всего 200 мкл) с инфекционной активностью не ниже 8,0 ЭИД 50/мл. Среднегеометрический уровень антител зависел от наличия адъюванта в составе вакцинного препарата и составил на 28 сутки для опытной группы 1,получавшей вакцину без хитозана - 125,4, для опытной группы 2 (получавшей вакцину с хитозаном) - 1304,4 в РТГА в сыворотках иммунизированных морских свинок. Определена иммуногенносгь вакцины с хитозаном на морских свинках, так среднегеометрические тигры антител в сыворотках крови были выше в 6-12 раз уровней антител, выявленных у морских свинок, привитых вакциной без адъюванта. Пример 6 Определение безвредности вакцины на жеребятах и жеребых кобылах Безвредность вакцины определяли в соответствии с требованиями МЭБ на жеребятах и жеребых кобылах. Для этого жеребятам годовалого возраста (4) и жеребым кобылам (вторая половина беременности) в возрасте 5 лет,серонегативным к вирусу гриппа субтипа Н 3 (титр антител в РТГА ниже чем 116) интраназально с помощью шприца- распылителя вводили вакцину,приготовленной по примеру 1 по 1 мл в каждую ноздрю. Жеребятам (3) и жеребым кобылам (3) из группы негативного контроля аналогичным образом вводили 0,05-ный раствор хитозана без вируса. Наблюдение за общим клиническим состоянием животных опытной и контрольной групп вели в течение 4 недель. При этом клиническое состояние здоровья животных оценивали по бальной системе. /. - 2004. - . 167.- . 150 157/ Ввиду того, что испытывается живая вакцина,провели исследование по определению степени выделения вируса у вакцинированных животных в окружающую среду через верхние дыхательные пути. Для этого у жеребят и жеребых кобыл опытной и контрольной групп на 3, 7, 14 сутки после вакцинации, брали пробы носоглоточных смывов в пробирки с 1 мл транспортной вирусной среды, которые титровали на 10-суточных куриных эмбрионах. Специфичность вируса, выделенного из носоглоточных смывов, определяли с помощью коммерческой экспресс тест-системы(-, США). Для выявления наличия возможных патоморфологических изменений в органах вакцинированных лошадей на 5 сутки после вакцинации жеребят опытной (1) и контрольной(п 1) групп подвергли эвтаназии для гистологических исследований. При этом у забитых животных отбирались пробы внутренних органов(легкие, печень, селезенка, головной мозг,лимфоузлы и пр.), из которых готовили 10-ные суспензии на фосфатнобуферном растворе с антибиотиками для титрования на 10-суточных куриных эмбрионах. В период срока наблюдения (21 сут) клиническое состояние иммунизированных животных,оцениваемое по бальной системе, было в пределах нормы, слезотечение, слизистогнойное выделение,признаки конъюнктивита или истечение из носа у жеребят не наблюдались, температура тела животных была в пределах нормальных значений. Репродукция вируса в верхних органах дыхания жеребят была очень слабой (на 1 и 3 сутки после вакцинации вирус выделялся лишь из цельных образцов), а у иммунизированных жеребых кобыл вирус не выделялся в течение всего срока наблюдения (1, 3, 5, 7 сутки). Гистологические исследования и титрование 10-ных суспензий органов, изъятых у вакцинированных жеребят,показало отсутствие деструктивных изменений в них и отсутствие репродукции вируса. Полученные данные подтверждают,что реассортантный холодоадаптированный штамм А/НК/О/62/2010,введенный интраназальным способом, не способен вызвать генерализацию инфекционного процесса, а репликация вируса происходит исключительно в верхних органах дыхания. Анализ экспериментальных данных позволяет заключить, что живая вакцина против гриппа лошадей из реассортантного холодоадаптированного штамма А/НК/О/62/2010 с хитозаном безвредна как для жеребят годовалого возраста, так и жеребых кобыл 5- летного возраста,при интраназальном введении в дозе 8,0 ЭИД 50/животное (по 1 мл в каждую ноздрю). Пример 7 Изучение иммуногенности живой интраназальной вакцины на лошадях Для определения гуморального иммунитета у жеребят годовалого возраста(опытная и контрольная группы), находящихся в опыте по оценке безвредности (пример 6) на 7, 14 и 28 сутки после вакцинации брали образцы крови для определения уровня накопления сывороточных антител в реакции торможения гемагглютинации(РТГА), реакции одиночного радиального гемолиза(РОРГ) и иммуноферментном анализе (ИФА). В аналогичные сроки после вакцинации брали образцы крови для исследования клеточного иммунитета в реакции бластотрансформации лейкоцитов (РБТЛ). Для сбора крови использовали стерильную иглу, шприц и стерильную пробирку,смоченную гепарином (0,1 мл на 5 мл крови). РТГА ставили согласно .. 2008,2.5.7. . 877-881, с использованием 1-ной взвеси эритроцитов петуха. ИФА ставили с коммерческой тест-системойА(, ) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Постановку РБТЛ проводили согласно Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля,Пер. с нем. А.П. Тарасова. - М. Медицина, 1987,с.472. Стимуляцию лимфоцитов проводили при использовании митогенного вещества фитогемагглютинина (ФГА) и антигенов штамма А/НК/О/62/2010 (38). В качестве контроля служили не стимулированные лимфоциты периферической крови. Результаты реакции выражали в индексах стимуляции. В результате было установлено, что у привитых животных не формируется детектируемый уровень антител в РТГА и ИФА на 7, 14 и 28 сутки после вакцинации, т. е. вакцина не обладает антигенными свойствами,что свойственно живым интраназальным вакцинам,которые характеризуются выраженным клеточным иммунным ответом. При оценке показателей клеточного иммунитета установлено, что вакцинация жеребят и жеребых кобыл живой вакциной способствует формированию у них выраженного клеточного иммунитета. В пролиферативном ответе клеток на специфический индуктор по данным индекса стимуляции у жеребят(2,430,32, 1,740,18) и жеребых кобыл (2,130,12,1,640,09) отмечены достоверные различия (в сравнении с контролем) в различные сроки исследования через 7 дней (Р 0,025) и 14 дней(Р 0,025, Р 0,05) после вакцинации. Пример 8 Определение протективности вакцины на модели контрольного заражения жеребят и жеребых кобыл На 28 сутки после вакцинации жеребят опытной(4) и контрольной (4) групп, вышедших из опыта по определению безвредности вакцины(пример 6), подвергли контрольному заражению эпизоотическим штаммом А/лошадь/О/764/07(38) вируса гриппа интраназальным способом с помощью шприца-распылителя в дозе 8,0 ЭИД 50/мл (в каждую ноздрю). За зараженными жеребятами опытной и контрольной групп в течение 28 суток вели клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела животных. Клиническое состояние инфицированных животных оценивали по бальной системе, указанной в опыте по определению безвредности вируса (пример 6). Для оценки степени репродукции вируса в верхних дыхательных путях у лошадей опытной и 7 контрольной групп на 3, 7, 14 сутки после заражения брали пробы носовых смывов в пробирки с 1 мл транспортной вирусной среды для титрования на 10- суточных КЭ. В результате было установлено, что все жеребята опытной группы проявляют устойчивость к заболеванию в течение всего срока наблюдения. Клиническое состояние инфицированных животных было в переделах нормы, температура тела также имела нормальные значения, однако выделение вируса в окружающую среду через верхние дыхательные пути было выявлено уже с первых суток и продолжалось вплоть до 5 суток после контрольного заражения. При этом титры выделяемого вируса (от 1,450,0 до 2,450,14 ЭИД 50/мл) лишь на 5 сутки п.и. были значительно меньше (Р 0,05) по сравнению с контрольной группой, а в остальные сроки наблюдения титры выделяемого вируса были сопоставимы с таковыми контрольной группы. Следует отметить, что в контрольной группе инфицированные жеребята проявляли ярко выраженные клинические признаки гриппозной инфекции с выделением большого количества вируса (от 1,450,0 до 4,20,14 ЭИД 50/мл) в окружающую среду до 7 суток после заражения. Единственным несвойственным гриппозной инфекции признаком было отсутствие повышенной (выше 39 С) температурной реакции у болеющих животных, что, по-видимому, связано со штаммовыми особенностями контрольного вируса,который вызывает доброкачественную форму гриппа с повышением температуры тела лишь у отдельных лошадей. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения живой интраназальной вакцины для профилактики гриппа лошадей,включающий заражение куриных эмбрионов рекомбинантным штаммом вируса гриппа, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости, введение стабилизатора и адъюванта, розлив в ампулы,лиофилизацию,отличающийся тем,что используют новый рекомбинантный холодоадаптированный штамм ///62/2010,который нарабатывают на куриных эмбрионах,комплексный стабилизатор состоит из пептона и лактозы в конечной концентрации 6 и 3,соответственно, а в качестве адъюванта добавляется олигосахарид хитозана в конечной концентрации 0,05.