Способ получения сухой культуральной вакцины против ринопневмонии лошадей из штамма equine rhinopneumonitis “k2c2″ av-0018 (казниви)

(51) 61 39/27 (2006.01) 61 31/12 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения сухой культуральной вакцины против ринопневмонии лошадей из штамма 22 -0018 (КазНИВИ),включающий репродукцию герпесвируса лошадей типа 1 из штамма СВ-69 в культуре клеток почки свиней, в качестве вирусного штамма используют герпесвируса лошадей типа 1, репродуцированный в монослойной перевиваемых клеток тестикул ягнят 3048 часового культивирования, полученной высевом в концентрации 30050 млн. клеток/см 3, при множественности заражения 0,05-0,1 ТЦД 50/кл,культивируют при температуре 37,0-37,5 С в течение 96-120 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 80 клеток, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 20-30 С, стабилизируют защитной средой и сублимируют в ампулах в объеме по 1,0-2,0 см 3 в режиме замораживания при температуре минус 5060 С в течение 3 ч, выпаривают жидкость вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, досушивают при температуре 20-22 С в течение 4-6 ч получают целевой продукт.(72) КУЛЬБАЕВА Камила Рустемовна КУТУМБЕТОВ Леспек Бекболатович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ ИЗ ШТАММА 22 -0018(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики ринопневмонии среди лошадей, вызываемой герпес вирусом лошадей типа 1. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достачно иммунизирующих доз. 21775 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики ринопневмонии среди лошадей,вызываемой герпесвирусом лошадей типа 1. Известен способ получения сухой культуральный вакцины против ринопневмонии лошадей, включающий репродукцию герпесвируса лошадей типа 1 из штамма СВ-69 в культуре клеток почек свиней Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей, -М., 2000, - с. 17-21. Недостатком известного способа получения вакцины против ринопневмонии лошадей является то, что биопрепарат не обладает достаточной биологической активностью и содержит в единице объема препарата малое количество иммунизирующих единиц. Задачей предлагаемого изобретения является повышение иммуногенности и биологической активности вакцины против ринопневмонии лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достачно иммунизирующих доз. Способ получения сухой культуральной вакцины против ринопневмонии лошадей из штамма 22 -0018 (КазНИВИ),включающий репродукцию герпесвируса лошадей типа 1 из штамма СВ-69 в культуре клеток почек свиней, в качестве вирусного штамма используют герпесвирус лошадей типа 122 -0018 (КазНИВИ), репродуцированный в монослойной культуре перевиваемых клеток тестикул ягнят 30-48 ч культивирования,полученной высевом в концентрации 30050 млн. клеток/см 3, при множественности заражения 0,050,1 ТЦД 50/кл, культивируют при температуре 37,037,5 С в течение 96-120 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 80 клеток, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 2030 С,стабилизируют защитной средой и сублимируют в ампулах в объеме по 1,0-2,0 см 3 в режиме замораживания при температуре минус 5060 С в течение 3 ч, выпаривают жидкость вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, досушивают при температуре 20-22 С в течение 4-6 ч и получают целевой продукт. Способ осуществляется следующим образом. Для приготовления вакцины против ринопневмонии лошадей культуральной сухой из герпесвируса типа 1 используют штамм, 22 -0018 (КазНИВИ). Штамм депонирован и хранится в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Казахский Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма 2 штамм К 2 С 2 -0018 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей не патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культуре клеток ТЯ-КК, которая способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из нее вакцинного препарта с высокими иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием иммунизирующих единиц в заданном объема. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток ТЯ-КК используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса на этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование культуры клеток и вируса в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус ринопневмонии лошадей относится к семейству, подсемейству , типу 1, вирионы вируса могут быть с оболочкой и без оболочки, размер вирионов вируса в пределах от 40 нм до 220 нм. Штамм К 2 С 2 -0018 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя ринопневмонии лошадей типа 1, подсемейства ,рода , семейства . Культуральные свойства. Штамм К 2 С 2 0018 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей репродуцируется и накапливается в культуре клеток ТЯ-КК в титре 1055 ТЦД 5 о/См 3 и выше (титр цитопатических доз, вызывающий клеточные поражения в монослое клеток у 50 инфицированной культуры, выращенной в сосудах). В указанных титрах штамм К 2 С 2 -0018(КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в указанной биологической модели и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,5 ТЦД 50/кл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 72-96 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 120-144 ч. Антигенные свойства. Штамм К 2 С 2 -0018(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей в организме привитых восприимчивых животных стимулирует образование вируснейтрализующих антител (5-7 2) и антигемагглютининов (3-5 2). Патогенные свойства. Штамм К 2 С 2 -0018(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей не патогенный. В организме привитых подкожно,внутримышечно лошадей, ослов и лабораторных животных (беспородные белые мыши, сирийские 21775 хомяки, морские свинки, кролики) не вызывает каких либо видимых патологических изменений. Иммуногенные свойства. Штамм К 2 С 2 0018 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей репродуцированный в культуре клеток ТЯ-КК в дозе от 1000 ТЦД 50 при подкожном введении у лошадей старше 12 месяцев вызывает напряженный иммунитет, который формируется на 12 сутки и продолжается в течение не менее 6 месяцев. Привитые животные полностью не восприимчивы к вирулентному вирусу. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма К 2 С 2-0018 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей при культивировании в культуре клеток ТЯ-КК сохраняются в течение не менее 10 последовательных пасажей (срок наблюдения). Сохранияемость. Штамм К 2 С 2 -0018(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 1820 С - 3 месяцев (срок наблюдения), а при минус 40 С - 6 месяцев (срок наблюдения). Лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой,содержащей пептон 3, сахарозу 4 и желатин 1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Пример 1. Для получения вакцины против ринопневмонии лошадей культуральной сухой готовят монослойную культуру перевиваемых тестикул ягнят путем высева в 1,5-литровые матрасы в концентрации 30050 млн. клеток/см 3,которые культивируют стационарным способом в среде ИГЛА-МЕМ, содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота при температуре 37,0-37,5 С в течение 30-48 ч до образования полного, но рыхловатого монослоя. В матрасы с культурой клеток без дегенеративных изменений вносят вирус герпесвирус лошадей типа 1 К 2 С 2 -0018 (КазНИВИ) в дозе 0,05-0,1 ТЦД 50/кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 48-72 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА- и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 48-72 ч, до развития цитопатогенного действия вируса на не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение не менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 370,5 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на отсутствие посторонних контаминантов и биологическую активность. Наличие возможных контаминантов устанавливают путем высева на бактериальные среды МПА, МПБ, среды Сабуро и Китта-Тароцци,а биологическую активность титрованием в монослойной культуре пересеваемых клеток тестикул ягнят,выращенных в пенициллиновых флаконах. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 1060 ТЦД 50/см 3 в культуральную суспензию для стабилизации добавляют в равных объемных соотношениях защитную среду, содержащую в своем составе 6 пептона, 8 сахарозы и 1 желатина полученную вируссодержащую биологическую жидкость разливают по 1,0 или 2,0 см 3 во флаконы и подвергают сублимационному высушиванию. Флаконы с сухой массой заполняют азотом или вакуумируют, горлышки укупоривают герметично резиновыми пробками,которые обкатывают алюминиевыми колпачками. Сухая форма вируссодержащего материала представляет собой компактную однородную серовато белого цвета с красноватым или кремовым оттенком таблеткообразную массу, которая после стандартизационных испытаний на иммунобиологические показатели используется в качестве вакцинного препарата. Иммунобиологические свойства сухой вакцины характеризуются следующими данными. Стерильность по отношению к посторонним контаминантам. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального, грибкового и вирусного характера. Безвредность. На безвредность вакцину проверяют на десяти мышах живой массой 18-20 г путем внутримышечного введения ее в дозе 0,5 см 3 содержащей десятикратно превышающий по титру вируса 7 иммунизирующую. У вакцинированных мышей в течение 10 суток после прививки не должны отмечаться какие либо патологии местного и общего характера. Реактогенность. Реактогенность вакцины проверяют на кроликах живой массой 2,0-2,5 кг не старше 12 мес внутремышечным введением растворенной вакцины в иммунизирующей дозе. Препарат должен быть слабо реактогенным. Реакция организма на введенную вакцину проявляется на 4-5 сутки повышением температуры тела на 0,5-0,7 С и кратковременным угнетением, которая продолжается не более 1 сут. Иммуногенность. Иммуногенность вакцины испытывают на мышах линий / живой массой 20-24 г. Для этого вакцину растворяют на стерильном разбавителе, разводят ею же до биологической активности 104 ТЦД 50/см 3 и вводят подкожно 10 лабораторным животным. Через 12 суток всех привитых и 10 аналогичных мышей, не привитых вакциной (контрольные), инфицируют вирулентным вирусом ринопневмонии лошадей в 3 дозе 10 ТЦД 50/см путем внутримышечного введения. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 12 суток у не менее чем 80 привитых мышей не проявятся каких либо патологий в общем состоянии и в месте введения вируса и у не менее чем 80 контрольных мышей заболевают с признаками воспалителной патологии верхних дыхательных путей. Инфекционная активность. Инфекционную активность определяют титрованием в культуре тестикулярных клеток ягнят,выращенных монослойно в пенициллиновых флаконах. Для этого из растворенного на физиологическом растворе или рабочем растворе Хенкса вакцины готовят десятикратные разведения и каждым разведением в дозе по 1,0 см 3 заражают культуру клеток в 4 флаконах. За зараженной культурой клеток наблюдают в течение 9 суток путем микоскопии и цитопатогенному воздействию вычисляют титр,рассчитывая по Риду и Менча. Титр вируса в сухой вакцине должен быть не ниже 1055 ТЦД 50/см 3. Применение способа получения сухой культуральной вакцины против ринопневмонии лошадей из штамма 22(КазНИВИ) позволит серийно изготавливать вакцину против ринопневмонии лошадей и внедрить этот препарат в ветеринарную практику для специфической профилактики заболевания среди конепоголовья. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения сухой культуральной вакцины против ринопневмонии лошадей из штамма 22 -0018 (КазНИВИ),включающий репродукцию герпесвируса лошадей типа 1 из штамма СВ-69 в культуре клеток почек свиней, отличающийся тем, что в качестве вирусного штамма используют герпесвирус лошадей типа 122 0018(КазНИВИ),репродуцированный в монослойной культуре перевиваемых клеток тестикул ягнят 30-48 ч культивирования,полученной высевом в концентрации 30050 млн. клеток/см 3, при множественности заражения 0,050,1 ТЦД 50/кл, культивируют при температуре 37,037,0 С в течение 96-120 ч до развития цитопатогенного действия в не менее, чем 80 клеток, собирают биомассу культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 2030 С,стабилизируют защитной средой и сублимируют в ампулах в объме по 1,0-2,0 см 3 в режиме замораживания при температуре минус 5060 С в течение 3 ч, выпаривают жидкость вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, досушивают при температуре 20-22 С в течение 4-6 ч и получают целевой продукт.