Способ получения антигена для диагностики сифилиса

(51) 61 39/02 (2006.01) 01 33/571 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения антигена для постановки специфических серологических реакций для диагностики сифилиса и для сохранения штамма бледных трепонем при пассировании на кроликах включает введение внутрь яичка кролика взвеси бледных трепонем с регулярным введением внутримышечно гидрокортизона, умерщвление кролика на три дня позже, через 10 дней после введения взвеси,выделение ткани яичка,измельчение,экстрагирование и центрифугирование. Трепонемный антиген, приготовленный предлагаемым способом,обладает улучшенным качеством за счет увеличения количества хорошо подвижных бледных трепонем, что повышает чувствительность РИФ и РИТ, а соответственно и серодиагностику 3,9 и 5,8, а специфичность на 11,6 и 3,9, что очень важно для снабжения практических серологических лабораторий Республики Казахстан.(72) Аскарова Гульсум Клышпековна Пшеничная Любовь Андреевна Утегенова Алия Казиевна Баев Асылжан Исаевич Нургалиева Алия Муратовна Маутканов Марат(73) Республиканское государственное казенное предприятие Научно-исследовательский кожновенерологический институт Министерства здравоохранения Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 4570, МПК А 61 К 39/002, 39/02, 1997(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА(57) Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии и может быть использовано для повышения чувствительности и специфичности реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и реакции иммобилизации бледных трепонем (РИТ) в диагностике сифилиса. 21774 Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии и может быть использовано для повышения качества диагностики сифилиса в реакции иммунофлюоресценции(РИФ) и реакции иммобилизации бледных трепонем (РИТ), в постановке которых широко используют трепонемный антиген, представляющий собой взвесь бледных трепонем из семенников (яичек) кролика с 7-дневным орхитом, зараженного сифилисом (Овчинников Н.М.,Беднова В.Н., Делекторский В.В., Москва, 1987 г.). Однако антиген, полученный известным способом,имеет некоторые недостатки малое количество бледных трепонем в темном поле зрения микроскопа(ниже 10-15 особей), во-вторых, их малая активность,хотя авторы и рекомендуют для подавления иммуногенеза вводить кортизон(редко,преимущественно тогда, когда существует момент потери штамма трепонем). Известен способ получения антигена для постановки специфических реакций в диагностике сифилиса, включающий введение внутрь яичка кролика взвесь бледных трепонем и экзогенной гиалуронидазы, а также введением в день заражения внутримышечно гидрокортизона по 1-1,5 мг(Кешилева З.Б. и соавт, 1997 г.). Однако в последние годы данный способ не применяется, так как возникли трудности в приобретении гиалуронидазы, а антиген по-прежнему необходим и в больших количествах, что очень важно для снабжения практических серологических лабораторий Республики Казахстан, поэтому для сравнения нами взят ранее известный способ получения антигена. Задачей является разработка способа получения антигена для лабораторной диагностики сифилиса,позволяющего повысить чувствительность и специфичность серологических реакций (РИФ и РИТ),а также увеличить выход антигена. Способ получения антигена для постановки специфических серологических реакций для диагностики сифилиса и для сохранения штамма бледных трепонем при пассировании на кроликах включает введение внутрь яичка кролика взвеси бледных трепонем с регулярным введением внутримышечно гидрокортизона,умерщвление кролика на три дня позже, через 10 дней после введения взвеси, выделение ткани яичка, измельчение,экстрагирование и центрифугирование. Способ осуществляется следующим образом. Для заражения берут здоровых кроликов-самцов весом 2-2,5 кг, выдержанных на карантине не менее 2-х недель. Предварительно у них исследуют сыворотку крови по комплексу серологических реакций(КСРРСКМР) и для заражения используют кроликов только с отрицательными результатами серологических реакций. Заражение осуществляется введением внутрь каждого яичка взвеси бледных трепонем, не менее 40-50 особей в темном поле зрения микроскопа в объеме 1,0-1,2 мл на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия. Для подавления иммуногенеза регулярно вводят по схеме внутримышечно гидрокортизон за один день до заражения - 15 мг, в день заражения - 15 мг и в 2 последующие три дня после заражения - по 20 мг. Введение гидрокортизона по данной схеме вызывает усиление размножения бледных трепонем и доступа их к месту дальнейшего размножения - секретоному эпителию тестикул. На 10-й день заражения кролика умерщвляют введением 20 см 3 воздуха в ушую вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира,освобождают от придатков и разрезают на 12-14 кусочков, которые затем помещают в стерильную колбочку,заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое колбочки встряхивают на Шуттель-аппарате до 30 минут. Затем жидкую часть содержимого колбы сливают в стерильные пробирки и центрифугируют при 1000 оборотах 5 минут. Из надосадочной жидкости готовят препараты для микроскопирования и определяют количество бледных трепонем в темном поле зрения (окуляр-7, объектив-40). Содержащуюся в пробирке густую взвесь бледных трепонем набирают в шприц и заражают подготовленных кроликов введением 1,0-1,2 мл взвеси внутрь каждого яичка. Для постановки реакции иммунофлюоресценции(РИФ - золотой стандарт по чувствительности в мире) взвесь бледных трепонем оставляют в холодильнике при 4 С на сутки, после чего надосадочную жидкость отделяют и при тех же условиях хранят. Для приготовления антигена выбирают ту взвесь, в которой не наблюдается агглютинация трепонем, имеется достаточное количество (30-40 особей), нет посторонней флоры и при испытании данной взвеси в РИФ с заведомо положительной сывороткой крови(больного сифилисом) получают яркое свечение . Антиген, отобранный для постановки реакции, можно сохранять в фиксированном виде на стекле до 6-8 месяцев. Для чего взвесь бледных трепонем разводят до 30-40 особей в темном поле зрения, готовят препараты на предметных стеклах, высушивают при комнатной температуре, фиксируют ацетоном в течение 10 минут и сохраняют в холодильнике при 1015 С в пенале для предметных стекол. Для постановки реакции иммобилизации бледных трепонем (РИТ -золотой стандарт по специфичности в мире) антиген готовят следующим образом следует развести взвесь бледных трепонем до концентрации 10-15 особей в темном поле зрения, так как при большом количестве трепонем трудно подсчитать количество иммобилизированных, и чувствительность иммунной сыворотки изменяется обратно пропорционально концентрации трепонем. Приготовленный антиген пригоден только для одной постановки, пока бледные трепонемы остаются живыми и активными. Результаты реакции оценивают через 18-20 часов, процент иммобилизации определяют по заранее составленной таблице. РИТ считается отрицательной,если процент иммобилизации колеблется в пределах 0-20,сомнительной - от 21 до 30, слабоположительной - от 31 до 50, положительной - выше 50 до 100. Для обеспечения более полного выхода бледных трепонем из тканей тестикул зараженного сифилисом кролика, к тканям тестикул добавляют изотонический раствор хлорида натрия (15-20 мл) и при встряхивании 21774 взвеси значительно увеличивается выход бледных трепонем. Встряхивание можно повторить 2-3 раза,что очень важно для увеличения количества антигена для снабжения практических лабораторий Республики Казахстан. Пример 1. У больного К. выставлен диагноз Сифилис скрытый ранний. Показатели РСК с кардиолипиновым антигеном 3, с трепонемным ультраозвученным антигеном - 3, микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном - 2,РИФ-абс - 3, РИТ - 48. В РИФ и РИТ был использован трепонемный антиген, приготовленный известным методом. Результаты специфических реакций с трепонемным антигеном, приготовленным на фоне введения гидрокортизона по предлагаемой схеме, были таковыми РИФ-абс - 4(титр 110), РИТ 54. Положительный эффект достигается тем, что чувствительность реакций повысилась, что является исключительным при постановке диагноза сифилиса и дальнейшей оценке лечения у больных скрытым ранним сифилисом. Пример 2. У больного Т. клинические и серологические исследования позволили выставить диагноз Сифилис вторичный рецидивный. Результаты КСР 4 с кардиолипиновым антигеном, отрицательный с трепонемным антигеном, МР преципитации 4,РИФ-абс - 3, РИТ - 58. При исследовании сыворотки крови в РИФ-абс и РИТ с использованием трепонемного антигена,приготовленного предлагаемым способом положительный результат в РИФ-абс 3 вырос до 4 (110), а РИТ до 98 иммобилизации бледных трепонем. Таким образом,данный способ повышает степень позитивности в РИФ на один порядок и РИТ - на 30. Пример 3. Больная И. Направлена из гинекологического стационара для обследования на сифилис. Результаты серологических реакций были слабоположительными РИФ-абс 2, РИТ - 38, РСК с двумя антигенами -3, МР дала отрицательный результат. При дальнейшем обследовании сыворотки крови в РИФ-абс и РИТ с использованием трепонемного антигена, приготовленного предлагаемым методом положительный результат в РИФ-абс 2 вырос до 4, а РИТ до 68 иммобилизации бледных трепонем. На основании последних результатов и клинических проявлений,врачи-клиницисты поставили диагноз вторичного свежего сифилиса и назначили соответствующее специфическое лечение. Пример 4. Больной М. Находился на стационарном лечении в терапевтическом отделении. При исследовании сыворотки крови этого больного МР преципитации с кардиолипиновым антигеном дала положительный результат 3, РИФ-абс с трепонемным антигеном, полученным известным способом, 4, на фоне отрицательных результатов РСК с двумя антигенами и РИТ 20. При повторных постановках с применением антигена,приготовленного предлагаемым способом, в РИТ и РИФ-абс получены отрицательные результаты,а предыдущие положительные результаты признаны как биологически ложноположительными. Таблица Эффективность известного и предлагаемого метода диагностики сифилиса Больные (кол-во) Сифилис вторичный ранний(10) Сифилис вторичный рецидивный (24) Сифилис скрытый ранний Трепонемный антиген,приготовленный предлагаемым способом, обладает улучшенным качеством за счет увеличения количества хорошо подвижных бледных трепонем, что повышает чувствительность РИФ и РИТ, а соответственно и серодиагностику 3,9 и 5,8, а специфичность на 11,6 и 3,9. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для диагностики сифилиса, включающий введение взвеси бледных трепонем внутрь яичка кролика и внутримышечно гидрокортизона, умерщвление кролика, выделение ткани яичка, ее измельчение, экстрагирование и центрифугирование, отличающийся тем, что при введении взеси бледных трепонем внутрь яичка кролика для подавления иммуногенеза дополнительно по схеме вводят внутримышечно 9,0 мг гидрокортизона с умерщвлением кролика на 10-ый день.