Способ получения сухой культуральной вакцины против оспы кур из штамма variola avium “кп-4″ № 0275 (казниви)

(51) 61 39/275 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения сухой культуральной вакцины против оспы кур из штаммаКП-40275 (КазНИВИ) включающего репродуцирование куриного вируса оспы из штамма ВГНКИ в культуре клеток кожи эмбрионов кур, что в качестве вирусного штамма используютКП 40275 (КазНИВИ) куриного вируса оспы,репродуцированного в монослойной культуре фибробластов развивающихся куринных эмбрионов,полученной высевом в концентрации 1,20,1 млн. клеток/см 3, при множественности заражения 0,050,1 ТЦД 50/кл, культивированием при температуре 37,0-37,5 С в течение 72-96 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 80 клеток, сбором биомассы культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 2030 С при интенсивном встряхивании, стабилизацией защитной средой и сублимированием в ампулах в объеме по 1,0-2,0 см 3 в режиме замораживания при температуре минус 50-60 С в течение 3 ч,выпаривания жидкости вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, затем сушкой нагреванием при температуре 20-22 С в течение 4-6 ч.(72) Кутумбетов Леспек Бекболатович Кульбаева Камила Рустемовна(56) Гуненков В.В., Чистова З.Я., Кузнецов Г.Д.,Ходасевич Н.Ф. Свойства сухой культуральной вакцины ВГНКИ против оспы птиц. Ветеринария 6, 1991, с.22-24(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ОСПЫ КУР ИЗ ШТАММАКП-40275 (КАЗНИВИ)(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики оспы среди птиц,вызываемой куриным вирусом. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достачно иммунизирующих доз. 21435 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано для специфической профилактики оспы среди птиц,вызываемой куриным вирусом. Известен способ получения сухой культуральный вакцины против оспы птиц,включающего репродуцирование куриного вируса оспы кур из штамма ВГНКИ в культуре клеток кожи эмбрионов кур Гуненков В.В, Чистова З.Я.,Кузнецов Г.Д., Ходасевич Н.Ф. Свойства сухой культуральной вакцины ВГНКИ против оспы птиц//Ветеринария.- 1991. -6. -с. 22- 24. Недостатком известного способа получения вакцины против оспы кур является то, что биопрепарат не обладает достаточной биологической активностью и содержит в единице объема препарата малое количество иммунизирующих доз. Задачей предлагаемого изобретения является повышение иммуногенности и биологической активности вакцины против оспы птиц. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивной вакцины, содержащей в единице объема готового продукта достачно иммунизирующих доз. Способ получения сухой культуральной вакцины против оспы кур из штаммаКП-4 0275 (КазНИВИ) куриноговируса, включающего использование штамма ВГНКИ куриного вируса оспы и кожной культуры развивающихся эмбрионов кур, в качестве вирусного штамма используютКП-4 0275 (КазНИВИ) репродуцированного в монослойной культуре фибробластов развивающихся куриных эмбрионов 24-30 часового культивирования, полученной высевом в концентрации 1,20,1 млн. клеток/см 3,при множественности заражения 0,05-0,1 ТЦД 50/кл культивированием при температуре 37,0-37,5 С в течение 72-96 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 80 клеток, сбором биомассы культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 20-30 С при интенсивном встряхивании,стабилизацией защитной средой и сублимированием в ампулах в объеме по 1,0-2,0 см 3 в режиме замораживания при температуре минус 50-60 С в течение 3 ч,полученную выпаривания жидкости вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, затем сушкой нагреванием при температуре 20-22 С в течение 46 ч. Способ осуществляется следующим образом. Для приготовления вакцины против оспы птиц культуральной сухой из куриного вируса используют штаммКП-4 0275(КазНИВИ). Штамм депонирован и хранится в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ). Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма. 2 ШтаммКП-4 0275 (КазНИВИ) не патогенен по отношению к естественно восприимчивой птице и обладает высокой репродуктивностью в культуре фибробластов куриных эмбрионов,которая способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из них вакцинных препаратов с высокими иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием иммунизирующих доз в единице объема. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛАМЕМ и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса на этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование фибробластов и вируса в них осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус оспы птиц относится к семейству , роду ,имеет липопротеидную оболочку, размер вирионов вируса в пределах 390 х 280 х 200 нм. Штамм(КазНИВИ) обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя оспы птиц рода , семейства . Культуральные свойства. ШтаммКП-4 0275 (КазНИВИ) репродуцируется и накапливается в первичной культуре фибробластов свободных от патогенной микрофлоры эмбрионов кур в титре 104,5 ИД 50/0,001 см 3 и выше (инфекционная доза, вызывающая в месте внутрикожного введения узелковое поражение у 50 не иммунных к оспе кур старше 2-х месячного возраста). В указанных титрах штаммКП-40275 (КазНИВИ) в фибробластах накапливается после двукратного последовательного пассирования в них и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,001-0,005 ИД 50/кл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных фибробластов куриных эмбрионов проявляется через 36 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 48 и 72 ч. Антигенные свойства. ШтаммКП-40275 (КазНИВИ) в организме привитых кур стимулирует образование вируснейтрализующих (2-52) и преципитирующих (1-32) антител. Патогенные свойства. ШтаммКП-40275 (КазНИВИ) не патогенный. У привитых внутрикожно путем прокола перепонки крыла двуигольным инъектором цыплят старше 30 суточного возраста не иммунных к оспе вызывает образование в месте инъекции оспенных узелков,которые проявляются на 7-9 сутки и заживают без каких либо последствий через 3-5 суток. Иммуногенные свойства. ШтаммКП-4 0275 (КазНИВИ) репродуцированный в 21435 культуре фибробластов куриных эмбрионов в дозе от 100 ИД 50 при внутрикожном введении путем прокола перепонки крыла у цыплят старше 30 суточного возраста вызывает напряженный иммунитет, который формируется на 7 сутки и продолжается в течение не менее 12 месяцев. Привитая птица полностью не восприимчива к вирулентному вирусу. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штаммаКП-40275 (КазНИВИ) при культивировании в культуре фибробластов эмбрионов кур сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохранияемость. ШтаммКП-4 0275 (КазНИВИ) в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 3 месяца, а при минус 40 С - 6 месяцев (срок наблюдения). Лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 3,сахарозу 4 и желатин 0,5-1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Пример 1. Для получения вакцины против оспы птиц культуральной сухой готовят монослойную культуру клеток фибробластов куриных эмбрионов путем высева в 1,5-литровые матрасы первичнотрипсинизированные фибробласты эмбрионов кур в концентрации 1,20,1 млн. клеток/см 3, которые культивируют стационарным способом в среде ИГЛА-МЕМ, содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота при температуре 37,037,5 С в течение 24-30 ч до образования полного плотного монослоя. В матрасы с культурой клеток без дегенеративных изменений вносят вирус в дозе 0,050,1 ТЦД 50/кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 24-30 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА-МЕМ и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 42-60 ч, до развития цитопатогенного действия вируса на не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение не менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 370,5 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на отсутствие посторонних контаминантов и биологическую активность. Наличие возможных контаминантов устанавливают путем высева на бактериальные среды МПА, МПБ, среды Сабуро и Китта-Тароцци,а биологическую активность титрованием в монослойной культуре фибробластов эмбрионов кур, выращенных в пенициллиновых флаконах. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 108,50 ТЦД 50/см 3 в культуральную суспензию для стабилизации добавляют в равных объемных соотношениях защитную среду, содержащую в своем составе 6 пептона, 8 сахарозы и 1 желатина и полученную вируссодержащую биологическую жидкость разливают по 1,0 или 2,0 см 3 во флаконы и подвергают сублимационному высушиванию. Флаконы с сухой массой заполняют азотом или вакуумируют, горлышки укупоривают герметично резиновыми пробками,которые обкатывают алюминиевыми колпачками. Полученная таким образом сухая форма вируссодержащего материала представляет собой компактную однородную серовато белого цвета с красноватым или кремовым оттенком таблеткообразную массу,которая после стандартизационных испытаний на иммунобиологические показатели используется в качестве вакцинного препарата. Иммунобиологические свойства сухой вакцины характеризуются следующими данными. Стерильность по отношению посторонних контаминантов. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального, грибкового и вирусного характера. Безвредность. На безвредность вакцину проверяют на десяти цыплятах старше 30-суточного возраста путем внутрикожного введения ее в дозе десятикратно превышающей иммунизирующую. У вакцинированных цыплят в течение 10 суток после прививки не должны отмечаться какие либо патологии местного и общего характера, кроме специфических оспенных узлов диаметром до 1,01,5 см в месте введения, которые появляются на 7-8 сутки и бесследно заживают через 2-4 суток. Реактогенность. Реактогенность вакцины проверяют на цыплятах, используемых параллельно в испытаниях иммуногенности препарата. Препарат должен быть слабо реактогенным. Реакция организма на введенную вакцину проявляется на 7-8 сутки только местным ответом, характеризующаяся образованием специфического оспенного узла в месте введения диаметром не более 1,0 см, который бесследно заживает через 2-4 суток. Иммуногенность. Иммуногенность вакцины испытывают на цыплятах старше 30-суточного возраста. Для этого вакцину растворяют на стерильном разбавителе, разводят ею же до биологической активности 102 ТЦД 50/0,001 см 3 и вводят внутрикожно двуигольным инъектором путем прокола перепонки крыла 20 цыплятам от 30 суточного возраста. Через 12 суток всех привитых и 20 аналогичных цыплят, не привитых вакциной 3(контрольные), инфицируют вирулентным куриным вирусом оспы в дозе 103 ЭИД 50/0,001 см 3 путем внутрикожного введения двуигольным инъектором. Привитой птице вирус вводят в противоположное крыло. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 12 суток у не менее чем 80 привтых цыплят не проявятся каких либо патологий в общем состоянии и в месте введения вируса и у не менее чем 80 контрольных цыплят образуются оспенные узелки в месте инокуляции возбудителя. Инфекционная активность. Инфекционную активность определяют титрованием в культуре фибробластов куриных эмбрионов, выращенных монослойно в пенициллиновых флаконах. Для этого из растворенного на физиологическом растворе или рабочем растворе Хенкса вакцины готовят десятикратные разведения и каждым разведением в дозе по 1,0 см 3 заражают культуру клеток в 4 флаконах. За зараженной культурой клеток наблюдают в течение 5 суток путем микоскопии и по цитопатогенному воздействию вычисляют титр,рассчитывая по Риду и Менча. Титр вируса в сухой вакцине должен быть не ниже 108 ТЦД 50/см 3. Пример 2. Для получения вакцины против оспы птиц культуральной сухой готовят суспензию культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов в концентрации 2,20,1 млн. жизнеспособных клеток/см 3, путем первичной трипсинизации 11-12 суточных эмбрионов кур которые инфицируют штамомКП-4 вируса оспы кур в дозе 0,1-0,5 ТЦД 50/кл и культивируют глубинным способом в среде ИГЛА-, содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота при температуре 37,0-37,5 С и рН среды 7,2-7,4 в течение 422 ч до уровня снижения содержания живых клеток в суспензии 102. В период установления такого количества живых клеток в суспензии содержимое реактора переносят в специальный сосуд и подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение не менее чем 3 ч. Затем культуральную суспензию размораживают при комнатной температуре или при температуре 370,5 С при периодическом механическом встряхивании и полученную массу суспензии подвергают испытанию на отсутствие посторонних контаминантов и биологическую активность. Наличие возможных контаминантов устанавливают путем высева на бактериальные среды МПА, МПБ, среды Сабуро и Китта-Тароцци,а биологическую активность титрованием в монослойной культуре фибробластов эмбрионов кур, выращенных в пенициллиновых флаконах. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 108,50 ТЦЦ 50/0,001 см 3 в культуральную суспензию для стабилизации добавляют в равных объемных соотношениях защитную среду, содержащую в своем составе 6 пептона, 8 сахарозы и 1 желатина и полученную вируссодержащую биологическую жидкость разливают по 1,0 или 2,0 4 см 3 во флаконы и подвергают сублимационному высушиванию. Флаконы с сухой массой заполняют азотом или вакуумируют, горлышки укупоривают герметично резиновыми пробками,которые обкатывают алюминиевыми колпачками. Полученная таким образом сухая форма вируссодержащего материала представляет собой компактную однородную серовато белого цвета с красноватым или кремовым оттенком таблеткообразную массу,которая после стандартизационных испытаний на иммунобиологические показатели используется в качестве вакцинного препарата. Иммунобиологические свойства сухой вакцины характеризуются следующими данными. Стерильность по отношению посторонних контаминантов. Стерильность вакцины испытывают согласно требованиям ГОСТ 28085. В вакцине не должны присутствовать посторонние контаминанты бактериального, грибкового и вирусного характера. Безвредность. На безвредность вакцину проверяют на десяти цыплятах старше 30-суточного возраста путем внутрикожного введения ее в дозе десятикратно превышающей иммунизирующую. У вакцинированных цыплят в течение 10 суток после прививки не должны отмечаться какие либо патологии местного и общего характера, кроме специфических оспенных узлов диаметром до 1,01,5 см в месте введения, которые появляются на 7-8 сутки и бесследно заживают через 2-4 суток. Реактогенность. Реактогенность вакцины проверяют на цыплятах, используемых параллельно в испытаниях иммуногенности препарата. Препарат должен быть слабо реактогенным. Реакция организма на введенную вакцину проявляется на 7-8 сутки только местным ответом, характеризующаяся образованием специфического оспенного узла в месте введения диаметром не более 1,0 см, который бесследно заживает через 2-4 суток. Иммуногенность, Иммуногенность вакцины испытывают на цыплятах старше 30-суточного возраста. Для этого вакцинурастворяют на стерильном разбавителе, разводят ею же до биологической активности 102 ТЦД 50/0,001 см 3 и вводят внутрикожно двуигольным инъектором путем прокола перепонки крыла 20 цыплятам от 30 суточного возраста. Через 12 суток всех привитых и аналогичных 20 цыплят, не привитых вакциной(контрольные), инфицируют вирулентным куриным вирусом оспы в дозе 103 ЭИД 50/0,001 см 3 путем внутрикожного введения двуигольным инъектором. Привитой птице вирус вводят в противоположное крыло. Вакцина считается иммуногенной, если в течение 12 суток у не менее чем 80 привтых цыплят не проявятся каких либо патологий в общем состоянии и в месте введения вируса и у не менее чем 80 контрольных цыплят образуются оспенные узелки в месте инокуляции возбудителя. Инфекционная активность. Инфекционную активность определяют титрованием в культуре фибробластов куриных эмбрионов, выращенных монослойно в пенициллиновых флаконах. Для этого 21435 из растворенного на физиологическом растворе или рабочем растворе Хенкса вакцины готовят десятикратные разведения и каждым разведением в дозе по 1,0 см 3 заражают культуру клеток в 4 флаконах. За зараженной культурой клеток наблюдают течение 5 суток путем микоскопии и по цитопатогенному воздействию вычисляют титр,рассчитывая по Риду и Менча. Титр вируса в сухой вакцине должен быть не ниже 108 ТЦД 50/см 3. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения сухой культуральной вакцины против оспы кур из штаммаП-4 0275(КазНИВИ) включающего репродуцирование куриного вируса оспы из штамма ВГНКИ в культуре клеток кожи эмбрионов кур,отличающийся тем, что в качестве вирусного штамма используютКП-40275(КазНИВИ) куриного вируса оспы,репродуцированного в монослойной культуре фибробластов развивающих куриных эмбрионов 2430 часового культивирования, полученной высевом в концентрации 1,20,1 млн. клеток/см 3, при множественности заражения 0,05-0,1 ТЦД 50/кл,культивированием при температуре 37,0-37,5 С в течение 72-96 ч до развития цитопатогенного действия в не менее чем 80 клеток, сбором биомассы культурального вируса однократным замораживанием при температуре минус 40 С и размораживанием при температуре 20-30 С при интенсивном встряхивании,стабилизацией защитной средой и сублимированием и ампулах в объеме по 1,0-2,0 см 3 В режиме замораживания при температуре минус 50-60 С в течение 3 ч,выпаривания жидкости вакуумом при 100 мм рт.ст. в течение 6-8 ч, затем сушкой нагреванием при температуре 20-22 С в течение 4-6 ч.