Штамм вируса ринопневмонии лошадей “к2с2″ № 0308 (казниви), используемый для изготовления вакцинного препарата

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ вируса ринопневмонии лошадей, пригодного для изготовления эффективной и повышенным количеством иммунизирующих в единице объема живой сухой вакцины против ринопневмонии лошадей. Штамм вируса ринопневмонии лошадей К 2 С 20308(КазНИВИ), семейства ,подсемейства , типа 1 (Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии),используемый для изготовления вакцинного препарата. Указанный штамм вируса ринопневмонии лошадей депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научноисследовательский институт ветеринарии(72) Кульбаева Камила Рустемовна Кутумбетов Леспек Бекболатович(54) ШТАММ ВИРУСА РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ К 2 С 20308 (КАЗНИВИ),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННОГО ПРЕПАРАТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для профилактики ринопневмонии лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма 21217 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для профилактики ринопневмонии лошадей. Известен аттенуированный штамм СВ-69 вируса ринопневмонии лошадей, применяемый для изготовления вакцины против ринопневмонии лошадей Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей/М., 2000, с.206. Недостатком данного штамма вируса является то, что он недостаточно активно репродуцируется в культурах клеток и вследствие чего титр накапливаемого вируса в культуральной биомассе невысокий, а изготавливаемый из такого вируса вакцинный препарат обладает низкой биологической активностью и содержит сравнительно малое количество иммунизирующих доз в единице объема. Задачей изобретения является получение штамма вируса ринопневмонии лошадей, пригодного для получения активной биомассы культурального вируса позволяющей изготавливать вакцину с высокой биологической активностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса ринопневмонии лошадей, пригодного для изготовления эффективной и повышенным количеством иммунизирующих в единице объема живой сухой вакцины против ринопневмонии лошадей. Штамм вируса ринопневмонии лошадей К 2 С 20308 (КазНИВИ), используемый для накопления биомассы возбудителя получают путем репродукции его в монослойной культуре клеток ТЯ-КК, поддерживаемой в лабораторных условиях. Указанный штамм вируса ринопневмонии лошадей депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научноисследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ). Штамм вируса ринопневмонии лошадей К 2 С 20308(КазНИВИ). Штамм получен из полевого эпизоотического вируса ринопневмонии лошадей, выделенного из органов абортированного плода лошади с клиническими признаками заболевания, путем аттенуации множественными пассажами в культуре клеток и селекции активных цитопатогенных популяций вирионов. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей не патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культуре клеток ТЯ-КК,которая способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из нее вакцинного препарата с высокими 2 иммунобиологическими параметрами и повышенным содержанием иммунизирующих доз в единице объема. Состав среды и условия культивирования для получения монослойной культуры клеток ТЯ-КК используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, для культивирования вируса на этой культуре клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование культуры клеток и вируса в ней осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус ринопневмонии лошадей относится к семейству, подсемейству , типу 1, вирионы вируса могут быть с оболочкой и без оболочки, размер вирионов вируса в пределах от 40 нм до 220 нм. Штамм К 2 С 20308 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя ринопневмонии лошадей типа 1, подсемейства ,рода , семейства . Культуральные свойства. Штамм К 2 С 20308 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей репродуцируется и накапливается в культуре клеток ТЯ-КК в титре 105,5 ТЦД 50/см 3 и выше (титр цитопатических доз, вызывающий клеточные поражения в монослое клеток у 50 инфицированной культуры, выращенной в сосудах). В указанных титрах штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в указанной биологической модели и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,5 ТЦД 50/кл Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 72-96 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в период между 120-144 ч. Антигенные свойства. Штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей в организме привитых восприимчивых животных стимулирует образование вируснейтрализующих антител (5-7 2) и антигемагглютининов (3-5 2). Патогенные свойства. Штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей не патогенный. В организме привитых подкожно,внутримышечно лошадей, ослов и лабораторных животных (беспородные белые мыши, сирийские хомяки, морские свинки, кролики) не вызывает каких либо видимых патологических изменений. Иммуногенные свойства. Штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей репродуцированный в культуре клеток ТЯ-КК в дозе от 1000 ТЦД 50 при подкожном введении у лошадей старше 12 месяцев вызывает напряженный иммунитет, который формируется на 12 сутки и продолжается в течение не менее 6 месяцев. Привитые животные полностью не восприимчивы к вирулентному вирусу. 21217 Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма К 2 С 20308 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей при культивировании в культуре клеток ТЯ-КК сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм К 2 С 20308(КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 1820 С - 3 месяцев (срок наблюдения), а при минус 40 С 6 месяцев(срок наблюдения). Лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 3, сахарозу 4 и желатин 1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Пример. Для приготовления вакцины штамм К 2 С 20308 (КазНИВИ) вируса ринопневмонии лошадей репродуцируют в монослойной культуре клеток ТЯ-КК,выращенных стационарным способом в среде ИГЛА-, содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Для инфицирования используют культуру клеток со сплошным рыхловатым монослоем без каких либо дегенеративных изменений, полученным в течение 24-48 ч культивирования после трипсинизации и высева клеток в сосуды. В культуральную жидкость монослойной культуры клеток в сосудах вносят заражающую вирусную суспензию в объеме,содержащем вирус в дозе 0,1-0,5 ТЦД 50/кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 72-96 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА- и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 48-72 ч, до развития цитопатогенного действия вируса в не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 37 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на стерильность и биологическую активность. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 106,0 ТЦД 50/см 3 биомассу вируса стабилизируют защитной средой, содержащей 4 пептона, 4 сахарозы и 1,0 желатина, путем смешивания их в равных объемных пропорциях. Полученную жидкую массу разливают во флаконы пенициллиновые или ампулы в дозе по 2,0 см 3 и подвергают сублимационному высушиванию. Полученную таким образом сухую форму вируса со стабилизатором используют в качестве вакцинного препарата и подвергают испытанию на иммунобиологические показатели. Образец вакцины,приготовленный из культурального вируса с титром 106,5 ТЦД 50/см 3,представляет собой таблеткообразную мелкопористую однородную сухую массу светлокремового цвета заключенную во флаконы. При проверке на стерильность микробиологические и микологические контаминанты не выявляются. Титр вируса в препарате, при титровании в культуре клеток ТЯ-КК, выращенной в пенициллиновых флаконах, составляет не ниже 106,0 ТЦД 50/см 3. В сыворотке крови лошадей, привитых подкожно сухой вакциной в дозе 1000 ТЦД 50/гол,через 21 сутки выявляются вируснейтрализующие антитела в титре 5,7 2, тогда как у контрольных аналогичных животных, не получавших вакцину, в сыворотке крови указанные антитела отсутствуют. Сыворотка крови вакцинированных лошадей обладает протективной способностью и в реакции биологической нейтрализации на беременных морских свинках. При одновременном внутрибрюшинном введении с вирулентным вирусом такая сыворотка крови защищает морских свинок от абортов с индексом 3,8 . Использование сыворотки крови контрольных(не вакцинированных) лошадей на таких же морских свинках не способствует протекции от заболевания у большинства из них. В испытаниях, проводимых на беременных морских свинках, при контрольном заражении вирулентным вирусом у всех вакцинированных не отмечают каких либо признаков заболевания, тогда как среди аналогичны контрольных (интактных) животных болезнь отмечали у более 80, которая характеризовалась абортами,угнетением и отсутствием их аппетита. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса ринопневмонии лошадей К 2 С 20308 (КазНИВИ), семейства ,подсемейства , типа 1 (Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии), используемый для изготовления вакцинного препарата.