Штамм вируса оспы коз “гк-35″ №0277 (казниви), используемый для изготовления вакцинного препарата

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса оспы коз, пригодного для изготовления эффективной и с повышенной биологической активностью живой сухой вакцины против оспенной болезни. Штамм вируса оспы коз ГК-350277(КазНИВИ),используемый для накопления биомассы возбудителя получают путем репродукции его в поддерживаемой в лабораторных условиях культуре клеток -91, ПО. Указанный штамм вируса оспы коз депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ).(72) Кульбаева Камила Рустемовна Кутумбетов Леспек Бекболатович(56) Абдураимов Е.О. Технология изготовления вакцины против оспы коз. Алматы, 2001, с.25(54) ШТАММ ВИРУСА ОСПЫ КОЗ ГК-350277 (КАЗНИВИ), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННОГО ПРЕПАРАТА(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для профилактики оспы коз. 21218 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для профилактики оспы коз. Известен аттенуированный штамм ЛКВ-20 вируса оспы коз, применяемый для изготовления вакцины против оспы коз Абдураимов Е.О. Технология изготовления вакцины против оспы коз//Авторефдисс. канд. наук. Алматы, 2001. с.25. Недостатком данного штамма вируса является то, что он репродуцируется только в культуре первично-трипсинизированных клеток почки ягнят и накапливается в них в сравнительно низких титрах. Вследствие чего процесс получения биомассы культурального вируса сезонный, не позволяет использовать стандартизированные биологические объекты-продуценты и концентрация получаемого вируса сравнительно низкая. Задачей изобретения является получение штамма вируса оспы коз, пригодного для непрерывного производства активной биомассы культурального вируса на стандартизированных биологических объектах, позволяющих изготавливать вакцину с высокой биологической активностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса оспы коз, пригодного для изготовления эффективной и с повышенной биологической активностью живой сухой вакцины против оспенной болезни. Штамм вируса оспы коз ГК-350277(КазНИВИ),используемый для накопления биомассы возбудителя получают путем репродукции его в поддерживаемой в лабораторных условиях культуре клеток -91, ПО. Указанный штамм вируса оспы коз депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ). Штамм вируса оспы коз ГК-350277(КазНИВИ). Штамм получен из недостаточно модифицированного лабораторного вируса оспы коз путем направленной аттенуации и адаптации в культуре клеток -91 с помощью множественных пассажей, а также селекции клонов вируса,сравнительно активных в репродукции в приведенной культуре клеток. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм ГК-350277(КазНИВИ) вируса оспы коз не патогенен по отношению к естественно восприимчивым животным и обладает высокой репродуктивностью в культурах клеток -91, ПО, которые способствуют накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема культуральной суспензии. Высокие концентрации вируса в культуральной суспензии обуславливают возможность получения из них вакцинных препаратов с высокими иммунобиологическими параметрами с применением стандартизированных 2 технологий поддержания и использования культур клеток. Состав среды и условия культивирования для получения монослойных культур клеток -91 и ПО используют ростовую среду содержащую 90 среды ИГЛА- и 10 сыворотки крови крупного рогатого скота, а для культивирования вируса на этих культурах клеток в составе данной среды уменьшают концентрацию сыворотки крови до 5. Культивирование клеток и вируса в них осуществляют при температуре 37-38 С. Морфологические признаки. Вирус оспы коз относится к семейству, имеет липопротеидную оболочку,размер вирионов вируса в пределах 200270300 нм. Штамм ГК-350277 (КазНИВИ) вируса оспы коз обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя оспы коз рода, семейства . Культуральные свойства. Штамм ГК-350277 (КазНИВИ) вируса оспы коз репродуцируется и накапливается в культуре клеток -91 в титре 105,5 ТЦД 50/см 3 и выше (инфекционная доза,вызывающая цитопатогенное поражение у 50 клеток, зараженных вирусом). В указанных титрах штамм ГК-350277 (КазНИВИ) в культуре клеток накапливается после двукратного последовательного пассирования в них и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,5 ТЦД 50/кл. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных клеток проявляется через 60-72 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади в - период между 96 и 144 ч. Антигенные свойства. Штамм ГК-350277(КазНИВИ) вируса оспы коз в организме привитых коз стимулирует образование вируснейтрализующих (3-5 2) и преципитирующих (1-3 2) антител. Патогенные свойства. Штамм ГК-350277(КазНИВИ) вируса оспы коз не патогенный. У коз,привитых подкожно,внутримышечно и внутривенно, вирус не вызывает каких либо видимых патологических изменений местного и общего характера. При внутрикожной инъекции на 5-7 сутки в месте введения вируса могут формироваться оспенные узелки размером от просяного зерна до горошины, которые через 3-4 дня исчезают бесследно. Иммуногенные свойства. Штамм ГК-350277(КазНИВИ) вируса оспы коз,репродуцированный в культурах клеток -91 и ПО в дозе от 1000 ТЦД 50 при подкожном и внутрикожном методах введения у коз вызывает напряженный иммунитет, который формируется на 10-12 сутки и продолжается в течение не менее 12 месяцев. Привитые козы полностью не восприимчивы к гомологичному вирулентному вирусу. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма ГК-3 50277 (КазНИВИ) вируса оспы коз при культивировании в культурах клеток -91 и ПО 21218 сохраняются в течение не менее 5 последовательных пасажей (срок наблюдения). Сохранияемость. Штамм ГК-350277(КазНИВИ) вируса оспы коз в культуральной суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 3 месяцев, а при минус 40 С - 6 месяцев (срок наблюдения). Лиофилизированный в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 4,сахарозу 5 и желатин 0,5-1,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев. Пример. Для приготовления вакцины против оспы коз штамм ГК-350277 (КазНИВИ) вируса оспы коз репродуцируют в монослойной культуре клеток -91 и ПО, выращенных стационарным способом в 1,5-литровых матрасах с использованием питательной среды ИГЛА-МЕМ,содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Для инфицирования используют клетки с полным рыхловатым монослоем без каких либо дегенеративных изменений, полученным в течение 24-30 ч культивирования после первичной трипсинизации и высева клеток в сосуды. В культуральную жидкость монослойной культуры клеток в сосудах вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 0,10,5 ТЦД 50/кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 60-72 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА- и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение до 96-144 ч, до развития цитопатогенного действия вируса в не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение не менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 37 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на стерильность и биологическую активность. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в культуральной суспензии не ниже 105,50 ТЦД 50/см 3 биомассу вируса стабилизируют защитной средой, содержащей 3 пептона, 4 сахарозы и 1,0 желатина, путем смешивания их в равных объемных пропорциях. Полученную жидкую массу разливают во флаконы пенициллиновые или ампулы в дозе по 2,0-4,0 см 3 и подвергают сублимационному высушиванию. Полученную таким образом сухую форму вируса со стабилизатором используют в качестве вакцинного препарата и подвергают испытанию на иммунобиологические показатели. Образцы вакцины представляют собой таблеткообразную мелкопористую однородную сухую массу светлокремового цвета заключенную во флаконы/ампулы. При проверке на стерильность микробиологические и микологические контаминанты не выявляются. Титр вируса в препарате, при титровании в культуре клеток,составляет не ниже 105,0 ТЦД 5 О/см 3. Козы,привитые подкожно/внутрикожно вакциной в дозе 1000 ТЦД 50/гол и выше, при контрольном заражении вирулентным вирусом в дозе 1000 ИД 50/ГОЛ через 10-12 суток после вакцинации, оказываются полностью устойчивыми к оспе и не заболевают. У всех контрольных (не вакцинированные) коз в месте введения вирулентного вируса на 5-7 сутки образуются оспенные узелки диаметром 1,0 см и более,повышается температура тела,отмечается генерализация оспенного процесса. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса оспы коз ГК-350277,рода(Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищество с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ, используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.