Штамм вируса гемморагической болезни кроликов “кг-2004″ № 0283 (казниви), используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ вируса геморрагической болезни кроликов,обеспечивающего получение диагностических препаратов с необходимой специфичностью и диагностической активностью по отношению к гомологичному вирусу и инактивированной вакцины с высокими иммуногенными свойствами. Штамм вируса геморрагической болезни кроликов КГ-20040283 (КазНИВИ), семейства, рода(Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ), используемый для диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов. Указанный штамм вируса геморрагической болезни кроликов депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии(72) Кульбаева Камила Рустемовна Кутумбетов Леспек Бекболатович Горелов Юрий Михалович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(54) ШТАММ ВИРУСА ГЕММОРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ КГ-20040283(КазНИВИ),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики геморрагической болезни кроликов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма 21219 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов. Известен вирулентный штамм вируса геморрагической болезни кроликов, используемый при изготовлении инактивированной вакцины и диагностикумов Бакулов И.А. и др. Ж.Ветеринария,1992. - 7. -с. 30. Недостатком данного штамма вируса является то, что он обладает гемагглютинирующей способностью и использование диагностических препаратов, приготовленных на его основе, для диагностики болезни,вызываемой не гемагглютинирующим вирусом может привести к неправильным результатам, а вакцина не обладать достаточной иммуногенностью. Задачей изобретения является получение штамма вируса геморрагической болезни кроликов,пригодного для получения биомассы вируса,которая позволит изготавливать инактивированную вакцину и диагностические препараты с достаточной иммуногенностью, диагностической активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса геморрагической болезни кроликов,обеспечивающего получение диагностических препаратов с необходимой специфичностью и диагностической активностью по отношению к гомологичному вирусу и инактивированной вакцины с высокими иммуногенными свойствами. Штамм вируса геморрагической болезни кроликов КГ-20040283 (КазНИВИ),используемый для накопления биомассы возбудителя,необходимой в изготовлении диагностических и вакцинных препаратов,получают путем репродукции его в организме здоровых взрослых кроликов живой массой не менее 2,0 кг и не иммунных против вирусной геморрагической болезни. Указанный штамм вируса геморрагической болезни кроликов депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ). Штамм вируса геморрагической болезни кроликов КГ-20040283 (КазНИВИ). Штамм получен из полевого эпизоотического вируса геморрагической болезни кроликов,выделенного из печени трупа кролика с характерными патологоанатомическими признаками заболевания, путем стабилизации последовательными пассажами на восприимчивых животных. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм КГ-20040283(КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов патогенен по отношению к взрослым кроликам, обладает активной репродуктивной способностью в организме этих животных и 2(104,0 ЛД 50/г), позволяющих готовить диагностикумы и инактивированную вакцину. Состав среды и условия культивирования для репродукции вируса и получения его биомассы используют здоровых взрослых кроликов живой массой не менее 2,0 кг не вакцинированных против этой болезни. Для репродукции и получения биомассы вируса,образцы возбудителя вводят подкожно в дозе 0,51,0 см 3 здоровым взрослым кроликам живой массой не менее 2,0 кг и через 48-72 ч от убитых больных или свежих трупов павших инфицированных кроликов собирают печень и используют ее в качестве вирруссодержащего материала. Инфицированных кроликов содержат в специальном виварном помещении с соблюдением правил биологической безопасности. Вируссодержащий материал собирают с соблюдением правил асептики,исключая контаминацию посторонними микроорганизмами и рассеивания вируса во внешнюю среду. Морфологические признаки. Вирус геморрагической болезни кроликов,не имеет липопротеидную оболочку, размер вирионов вируса в пределах от 28 до 33 нм. Штамм КГ-20040283 (КазНИВИ) вируса обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя вирусной геморрагической болезни кроликов рода ,семейства . Культуральные свойства. Штамм КГ-20040283 (КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов репродуцируется и накапливается только в организме взрослых кроликов,не иммунизированных против приведенной болезни. В других биологических системах вирус не размножается Антигенные свойства. Штамм КГ-20040283(КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов в организме мышей, морских свинок, кози в инактивированном виде в организме кроликов стимулирует образование вируснейтрализующих антител (3-5 2 и выше). Патогенные свойства. Штамм КГ-20040283(КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов патогенный по отношению к взрослым кроликам живой массой не менее 2,0 кг не зависимо от породы. Среди зараженных кроликов, данный штамм вируса вызывает заболеваемость не ниже 80. Патогенность проявляется через 48 ч после инфицирования и до 72 ч вызывает гибель всех заболевших животных. Иммуногенные свойства. Штамм КГ-20040283(КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов репродуцированный в организме кроликов вызывает заболевание с высоким процентом гибели. У кроликов,выживших после заражения и у животных, которые подверглись иммунизации инактивированным вирусом,формируется иммунитет, который полностью защищает 21219 организм от повторных введений вирулентного возбудителя. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма КГ 20040283 (КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов при культивировании в организме здоровых восприимчивых животных (кроликов),сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм КГ-20040283(КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов в ткани и тканевой суспензии сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 30 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 6 месяцев, а при минус 40 С - 24 месяца. Лиофилизированный вирус в смеси со стабилизирующей средой, содержащей пептон 4, сахарозу 5 и желатин 0,5-1,0,сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев,при минус 40 С - 3 года. Пример 1. Для приготовления инактивированной вакцины штамм КГ-20040283 (КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов репродуцируют и накапливают в организме здоровых взрослых кроликов. С целью репродукции и получения биомассы вируса, образцы возбудителя в виде 20-ой вируссодержащей печеночной суспензии разведенной на фосфотно-буферном или забуференном физиологическом растворе в соотношении 110 вводят подкожно в дозе 1,0 см 3 здоровым взрослым кроликам живой массой не менее 2,0 кг и наблюдают за ними в течение 48-72 ч. В состоянии агонии заболевших кроликов или сразу после гибели их трупы вскрывают в асептических условиях, извлекают печень, которую помещают в стерильный широкогорлый сосуд и промораживают при температуре минус 40 С в течение не менее 4-6 ч. Затем печеночную ткань размораживают при комнатной температуре, размельчают и готовят на фосфатно-буферном растворе с рН 7,2-7,4 20 суспензию. Полученную суспензию фильтруют через 4-х слойную стерильную марлевую салфетку и центрифугируют при 3000 в течение 30 мин. Осадок удаляют, а надосадок используют в качестве вируссодержащей суспензии. В полученную таким образом вируссодержащую тканевую суспензию добавляют инактивант(формальдегид) в конечной концентрации 0,1 и выдерживают при температуре 370,5 С в течение 48 ч. Остатки формальдегида нейтрализуют сульфитом натрия и подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085. Проверяют полноту инактивации вирионов заражением 6 взрослых кроликов, не иммунных к вирусу геморрагической болезни в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов,способных к репродукии,инактивированную вирусную массу смешивают с 3 гелью гидроокиси алюминия, тщательно перемешивают и подвергают сорбции при температуре 20-25 С в течение 24. Полученную таким образом однородную светлокоричневого цвета, выпадающий в осадок при длительном хранении и суспензию используют в качестве инактивированной вакцины для иммунизации. Кроликов иммунизируют внутримышечной инъекцией вакцины в дозе 0,5 см 3. Для проверки иммуногенности испытуемого препарата привитых кроликов в количестве 4 гол подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом в дозе по 103 ЛД 50/гол на 12 сутки после вакцинации. Таким же образом заражают вирусом 4 контрольных(не вакцинированных) кроликов аналогичного возраста. За поголовьем опытной и контрольной групп кроликов наблюдают в течение 14 суток. За указанный период все вакцинированные кролики остаются здоровыми и живыми, а не менее чем 3 гол контрольных животных заболевают и погибают от геморрагической болезни кроликов. Пример 2. Для приготовления диагностического антигена штамм КГ-20040283 (КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов репродуцируют в организме здоровых взрослых кроликов. Получают вируссодержащую печеночную ткань, из которой готовят 20 суспензию на забуференном физиологическом растворе с рН 7,27,4. Суспензию фильтруют и очищают от тканевых элементов центрифугированием при 10 000 ,инактивируют формальдегидом в конечной концентрации инактиванта 0,1 и подвергают сублимационной сушке в ампулах или флаконах. Сухие образцы инактивированного вируса используют в качестве специфического антигена в реакции преципитации, связывания комплемента и иммуноферментного анализа с исследуемыми сыворотками на содержание специфических антител. Пример 3. Для приготовления специфической сыворотки штамм КГ-20040283 (КазНИВИ) вируса геморрагической болезни кроликов репродуцируют в организме здоровых взрослых кроликов. Получают вируссодержащую печеночную ткань, из которой готовят 20 суспензию на забуференном физиологическом растворе с рН 7,27,4. Суспензию фильтруют и очищают от тканевых элементов центрифугированием при 10 000 ,инактивируют формальдегидом в конечной концентрации инактиванта 0,1, сорбируют гелью гидроокиси алюминия. Полученной смесью иммунизируют кроликов подкожным введением этого препарата в дозе по 1,0 см 3. Через 30 суток этим же кроликам внутривенно вводят не инактивированный, не сорбированный, очищенный вирулентный вирус в дозе по 2,0 см 3. Через 14 суток после инокуляции вирулентного вируса кроликов обескровливают, собирая кровь в цилиндры. Из крови получают сыворотку, которую используют в качестве специфической сыворотки на вирус геморрагической болезни кроликов. 21219 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса гемморагической болезни кроликов КГ-20040283 (КазНИВИ), семейства изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.