Штамм вируса болезни ньюкасла “алматы-03″ № 0287 (казниви), используемый для изготовления вакцинных препаратов и диагностикумов

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса болезни Ньюкасла, обеспечивающего получение диагностических препаратов с помощью менее трудоемких технологий и инактивированной вакцины с высокими иммуногенными свойствами. Штамм вируса болезни Ньюкасла Алматы-030287 (КазНИВИ), семейства Раау,рода(Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищество с ограниченной ответственностью Научноисследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ), используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Указанный штамм вируса болезни Ньюкасла депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ).(72) Кульбаева Камила Рустемовна Кутумбетов Леспек Бекболатович Сулейменов Ринат Танатарович(56) Скутарь И.Г. Профилактика ньюкаслской болезни в условиях промышленного птицеводства. Автореф.дисс. док.вет.наук. М., 1983, с.29(54) ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА АЛМАТЫ-03(КАЗНИВИ),ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ И ДИАГНОСТИКУМОВ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики болезни Ньюкасла. 21216 Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано при изготовлении биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики болезни Ньюкасла. Известны лентогенный Ла-Сота и мезогенный Н штаммы вируса болезни Ньюкасла,используемые при изготовлении живых и инактивированных вакцин 1. Лихачев Н.В., Агеева Л.С.,Зубцова Р.Н. Изготовление сухой вирусвакцины против псевдочумы птиц из штамма Ла-Сота и испытание ее иммунобиологических свойств//Тр. ГНКИ. -1968. -т.15. -с. 3-7 2. Скутарь И.Г. Профилактика ньюкаслской болезни в условиях промышленного птицеводства Автореф.дисс.док. вет.наук. -М., 1983. -с. 29. Недостатками данных штаммов вируса являются то, что они обладают недостаточной антигенностью и сравнительно слабо стимулируют иммунитет в организме птицы, а сформированные факторы иммунитета (специфические антитела) быстро элюируют из организма, в связи с чем для приготовления инактивированного вакцинного препарата и иммунной сыворотки требуются концентрированные препараты возбудителя. Задачей изобретения является получение штамма вируса болезни Ньюкасла, пригодного для получения активной биомассы вируса позволяющая изготавливать вакцину и диагностические препараты с высокой иммуногенной и диагностической активностями. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении штамма вируса болезни Ньюкасла, обеспечивающего получение диагностических препаратов с помощью менее трудоемких технологий и инактивированной вакцины с высокими иммуногенными свойствами. Штамм вируса болезни Ньюкасла Алматы-030287 (КазНИВИ), используемый для накопления биомассы возбудителя, необходимой в изготовлении диагностических и вакцинных препаратов,получают путем репродукции его в 10-11-суточных развивающиеся куриные эмбрионы(РКЭ),свободных от патогенных микроорганизмов. Указанный штамм вируса болезни Ньюкасла депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научно-исследовательский институт ветеринарии (КазНИВИ). Штамм вируса болезни Ньюкасла Алматы-030287 (КазНИВИ). Штамм получен из полевого эпизоотического вируса болезни Ньюкасла, выделенного от трупа курицы с характерными патологоанатомическими признаками заболевания путем клонирования отдельных вирионов с помощью инокуляции РКЭ предельными разведениями вирусного материала и отбора среди них популяции со сравнительно высокими антигенными и патогенными характеристиками. Полученный штамм характеризуется следующими признаками. Назначение штамма штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла 2 патогенен по отношению к естественно восприимчивой птице (виды отряда куриных) и обладает высокой репродуктивностью в РКЭ,которые способствует накоплению вирионов вируса в повышенных концентрациях в единице объема экстраэмбриональной жидкости. Высокие концентрации вируса в биоматериале обуславливают возможность получения из них вакцинного препарата с высокими иммунобиологическими параметрами и диагностикумов с активными диагностическими компонентами. Состав среды и условия культивирования для культивирования вируса и получения его биомассы используют РКЭ 10-11 -суточного возраста свободных от патогенной микрофлоры. Указанные эмбрионы получают путем инкубации оплодотворенных яиц кур, свободных от патогенной микрофлоры, в течение 10-11 суток в условиях поддерживающих температуру в пределах 37-38 С,влажности воздуха - не ниже 60 и обеспечивающих периодический воздухообмен и изменение положения яиц. Для культивирования и получения биомассы вируса, образцы возбудителя вводят в экстраэмбриональную полость РКЭ и инкубируют их дополнительно в тех же условиях,что и до заражения. Для инкубации яиц с РКЭ используют стандартные автоматизированные или полуавтоматизированные инкубаторы яиц для выведения цыплят. Морфологические признаки. Вирус болезни Ньюкасла ( ) относится к семейству,имеет липопротеидную оболочку, размер вирионов вируса в пределах от 120 до 300 нм. Штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса обладает Морфологическими признаками,свойственными для возбудителя болезни Ньюкасла рода , семейства . Культуральные свойства. Штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцируется и накапливается в РКЭ и первичной культуре фибробластов эмбрионов кур,свободных от патогенной микрофлоры, в титре 108,5 ЭИД/ЛД 50/см 3 и выше (инфекционная доза,вызывающая инфекционный процесс у 50 зараженных РКЭ летальная доза, вызывающая гибель у 50 зараженных цыплят). В указанных титрах штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) в РКЭ и фибробластах накапливается после двукратного последовательного пассирования в них и при использовании множественности заражения вирусом равной 0,1-0,01 ЭИД 50/кл для фибробластов и 103-104 ЭИД 50 для РКЭ. Цитопатогенное действие вируса в монослое зараженных фибробластов куриных эмбрионов проявляется через 48 ч после инфицирования и охватывает более 80 его площади на 5-7 сутки, в экстраэмбриональной жидкости РКЭ вирус в максимальных титрах накапливается на 56-65 ч после заражения. Антигенные свойства. Штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла в организме не восприимчивых видов птицы и 21216 животных стимулирует образование антигемагглютининов (5-7 2 и выше) и вируснейтрализующих антител (5 2 и выше). Патогенные свойства. Штамм Алматы-030287(КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла патогенный по отношению ко всем видам птицы из отряда куриных. Среди зараженных цыплят 25-30-суточного возраста не иммунных к болезни Ньюкасла, данный штамм вируса вызывает 100 заболеваемость, которая заканчивается летальным исходом с таким же показателем процента в течение 3-7 суток. Иммуногенные свойства. Штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцированный в РКЭ в дозе от 1,0 ЭИД 50 вызывает заболевание без случаев выздоровления. Поэтому установление иммуногенности живого вируса на использованных цыплятах не представляет возможности. Для этой цели используют инактивированный вирус, который при внутримышечном введении стимулирует формирования в организме привитой птицы факторов иммунитета (антигемагглютининов и вируснейтрализующих антител), которые защищают от контрольного заражения вирулентным вирусом. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла при культивировании в РКЭ, свободных от патогенной микрофлоры, сохраняются в течение не менее 10 последовательных пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм Алматы-030287(КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла в экстраэмбриональной жидкости сохраняет свою исходную биологическую активность при температуре 41 С в течение 40 суток (срок наблюдения), при минус 18-20 С - 3 месяцев, а при минус 40 С - 12 месяцев. Лиофилизированный вирус в смеси со стабилизирующей средой,содержащей пептон 4, сахарозу 5 и желатин 0,51,0, сохраняет биологическую активность при температуре 41 С в течение не менее 12 месяцев,при минус 40 С - 3 года. Пример 1. Для приготовления инактивированной вакцины штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцируют в монослойной культуре фибробластов свободных от патогенной микрофлоры эмбрионов кур,выращенных стационарным способом в среде ИГЛА-, содержащей 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Для инфицирования используют клетки со сплошным рыхловатым монослоем без каких либо дегенеративных изменений, полученным в течение 24-30 ч культивирования после первичной трипсинизации и высева фибробластов в сосуды. В культуральную жидкость монослойной культуры клеток в сосудах вносят заражающую вирусную суспензию в объеме,содержащем вирус в дозе 0,1-0,01 ЭИД 50/кл и продолжают инкубировать культуру клеток в сосудах в течение до появления цитопатогенного действия, обычно этот срок составляет 44-50 ч. Из сосудов с зараженной культурой клеток удаляют ростовую питательную среду и вносят поддерживающую, содержащую в составе среду ИГЛА- и 5 сыворотки крови крупного рогатого скота. Культуру клеток с вирусом после замены питательной среды инкубируют при той же температуре еще в течение 72-120 ч, до развития цитопатогенного действия вируса в не менее чем 80 площади монослоя клеток. В период максимального развития цитопатогенного действия вируса культуру клеток в сосудах подвергают замораживанию при температуре минус 40 С в течение менее чем 3 ч. Затем содержимое сосудов размораживают при комнатной температуре или при температуре 37 С при периодическом механическом встряхивании. Содержимое нескольких аналогичных сосудов объединяют и полученную культуральную суспензию подвергают испытанию на стерильность и биологическую активность. При отсутствии посторонних контаминантов микробиологического, микологического характера и наличии титра вируса в суспензии не ниже 109,0 ЭИД 50/см 3 биомассу вируса фильтруют через 4-х слойную стерильную марлевую салфетку,добавляют инактивант (формальдегид) в конечной концентрации 0,1 и выдерживают при температуре 370,5 С в течение 36 ч. Остатки формальдегида нейтрализуют сульфитом натрия и подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и на полноту инактивации вирионов заражением 10-суточных РКЭ в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов, способных к репродукции, культуральную биомассу с инактивированным вирусом смешивают с адъювантом Монтанид ИЗА-70 и подвергают эмульгированию. Полученную таким образом белую с розовато красным оттенком стойкую однородную эмульсию используют в качестве инактивированной вакцины для иммунизации. Птицу иммунизируют внутримышечной инъекцией вакцины в дозе 0,5 см 3. Для проверки иммуногенности испытуемого препарата привитую птицу в количестве 10 гол подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом в дозе по 104 ЛД 50/гол на 14 сутки после вакцинации. Таким же образом заражают вирусом 10 контрольных (не вакцинированных) цыплят аналогичного возраста. За поголовьем опытной и контрольной групп птицы наблюдают в течение 14 суток. За указанный период не менее чем 8 гол вакцинированной птицы остаются здоровыми и живыми, тогда как не менее чем 8 гол контрольной птицы заболевают и погибают от болезни Ньюкасла. Пример 2. Для приготовления инактивированной вакцины штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцируют в 10 суточных РКЭ свободных от патогенной микрофлоры. В аллантоисную полость эмбрионов асептический вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 103104 ЭИД 50 и продолжают инкубировать их при температуре 37-38 С. Через 605 ч после введения вируса эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 С в течение 4-18 ч, асептически вскрывают и 3 21216 собирают экстраэмбриональную жидкость, которую затем подвергают фильтрации через 4-х слойную марлевую салфетку и испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и биологическую активность титрованием на РКЭ. Очищенную, стерильную и имеющий титр вируса не ниже 109,0 ЭИД 50/см 3 экстраэмбриональную жидкость обрабатывают формальдегидом в концентрации 0,1 при температуре 370,5 С в течение 36 ч. Остатки формальдегида нейтрализуютсульфитом натрия и биомассу подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и полноту инактивации вирионов заражением 10-суточных РКЭ в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов, способных к репродукции, культуральную биомассу с инактивированным вирусом смешивают с адъювантом Монтанид ИЗА-70 и подвергают эмульгированию. Полученную таким образом белую стойкую однородную эмульсию используют в качестве инактивированной вакцины для иммунизации. Птицу иммунизируют внутримышечной инъекцией вакцины в дозе 0,5 см 3. Для проверки иммуногенности испытуемого препарата привитую птицу в количестве 10 гол подвергают контрольному заражению вирулентным вирусом в дозе по 104 ЛД 50/гол на 14 сутки после вакцинации. Таким же образом заражают вирусом 10 контрольных(не вакцинированных) цыплят аналогичного возраста. За поголовьем опытной и контрольной групп птицы наблюдают в течение 14 суток. За указанный период не менее чем 8 гол вакцинированной птицы остаются здоровыми и живыми, тогда как не менее чем 8 гол контрольной птицы заболевают и погибают от болезни Ньюкасла. Пример 3. Для приготовления диагностического антигена штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцируют в 10 суточных РКЭ свободных от патогенной микрофлоры. В аллантоисную полость эмбрионов асептический вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 103104 ЭИД 50 и продолжают инкубировать их при температуре 37-38 С. Через 605 ч после введения вируса эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 С в течение 4-18 ч, асептически вскрывают и собирают экстраэмбриональную жидкость, которую затем подвергают фильтрации через 4-х слойную марлевую салфетку и испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и гемагглютинируюшую активность титрованием в реакции геагглютинации с эритроцитами петуха. Очищенную,стерильную и имеющий гемагглютинирующий титр не ниже 7 2 биомассу вируса обрабатывают формальдегидом в концентрации 0,1 при температуре 370,5 С в течение 36 ч. Остатки формальдегида нейтрализуют сульфитом натрия и биомассу подвергают испытанию на стерильность по ГОСТ 28085 и на полноту инактивации вирионов заражением 10 суточных РКЭ в трех последовательных пассажах. В случае отсутствия посторонних контаминантов и вирионов вируса болезни Ньюкасла, способных к репродукции, смешивают с сахароза-пептонножелатиновой средой в соотношении 11 по объему и полученную массу в объеме по 1,0 см 3 подвергают сублимационной сушке в ампулах или флаконах. Высушенную форму вируса используют в качестве диагностического антигена после растворения физиологическим раствором и разведения до гемагглютинирующей активности 4 ГАЕ для выявления специфических антител в реакции торможения гемагглютинации. Пример 4. Для приготовления специфической сыворотки штамм Алматы-030287 (КазНИВИ) вируса болезни Ньюкасла репродуцируют в 10 суточных РКЭ свободных от патогенной микрофлоры. В аллантоисную полость эмбрионов асептический вносят заражающую вирусную суспензию в объеме, содержащем вирус в дозе 103104 ЭИД 50 и продолжают инкубировать их при температуре 37-38 С. Через 605 ч после введения вируса эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 С в течение 4-18 ч, асептически вскрывают и собирают экстраэмбриональную жидкость, которую затем подвергают фильтрации через 4-х слойную марлевую салфетку и испытанию на стерильность по ГОСТ 28085,биологическую и гемагглютинирующую активности титрованием в РКЭ и в реакции геагглютинации с эритроцитами петуха. Очищенную,стерильную и имеющий гемагглютинирующий титр не ниже 7 2, а также инфекционный титр 109 ЭИД 50 и выше биомассу вируса в дозе по 106 ЭИД 50 вводят внутримышечно перепелам. Через 14 и 30 суток иммунизацию повторяют, а на 37-40 сутки собирают кровь у гипериммунизированной птицы после декапитизации. Из крови получают сыворотку,которую исследуют на содержание антигемагглютининов. Полученную сыворотку сублимируют без стабилизаторов в дозе по 0,5 см 3 в ампулах или флаконах. Сухую сыворотку используют в качестве специфической для идентификации возбудителя болезни в реакции торможения гемагглютинации. 21216 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм вируса болезни Ньюкасла Алматы-030287 (КазНИВИ), семейства Раа,рода(Лаборатория по изучению генофонда микроорганизмов Товарищества с ограниченной ответственностью Научноисследовательский институт ветеринарии(КазНИВИ, используемый для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.