Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа о для серологических реакций при ящуре животных

(51) 61 39/135 (2011.01) 12 7/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ организму крольчат, забивание больных крольчат,измельчение и растирание тушек, приготовление суспензии, экстрагирование, замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование,центрифугирование и получение надосадочной жидкости, при этом используют штамм -0026(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О, который адаптируют к организму 2-3-суточных крольчат,забивают крольчат в период выраженной клиники ящура, тушки крольчат измельчают в мясорубке,затем гомогенезируют на размельчителе тканей и готовят 33 суспензию на фосфатно-буферном растворе, добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1,0 см 3 суспензии и экстрагируют при температуре 15-18 в течение 2 часов, после чего дважды замораживают при температуре минус 40 в течение 24 часов и дефростируют при температуре 8, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин,полученную надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, после чего вируссодержащую суспензию эмульгируют 5 хлороформом в течение 20 мин,затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, после чего вируссодержащую суспензию сливают в стерильные флаконы, инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 часов, после чего вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин,полученную надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4 пептон, 3 сахарозы и 1 желатин в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна Калисынов Берик Серикбаевич Есходжаев Олжас Умирзахович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ ШТАММА ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА О ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ЯЩУРЕ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики ящура и выявления антител в сыворотки крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при ящуре и выявления комплементсвязывающих антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена из штамма ящура типадля серологических реакций при ящуре животных включающий адаптацию вируса ящура к 25462 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики вируса ящура и выявления антител в сыворотки крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Известен способ получения антигена типа О для серологических реакций при ящуре животных,включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение и растирание тушек, приготовление суспензии,экстрагирование, замораживание и оттаивание,концентрирование и инактивирование,центрифугирование и получение надоеадочной жидкости (Салажов Е.П. Ветеринарные препараты. М Колос, 1981, с. 66-73). Однако такой антиген не обладает достаточной активностью для выявления антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Задачей изобретения является разработка способа получения стабильного антигена типа О для серологических реакций при ящуре животных,позволяющего выявлять возбудителей ящура и обладающего достаточной активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при ящуре и выявления комплементсвязывающих антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа О для серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение и растирание тушек,приготовление суспензии,экстрагирование,замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, при этом используют штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О, который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают крольчат в период выраженной клиники ящура, тушки крольчат измельчают мясорубке, затем гомогенизируют на размельчителе тканей и готовят 33 суспензию на фосфатно-буферном растворе,добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1,0 см 3 суспензии и экстрагируют при температуре 15-18 в течение 2 часов, после чего дважды замораживают при температуре минус 40 в течение 24 часов и дефростируют при температуре 8, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин,надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, после чего вируссодержащую суспензию эмульгируют 5 хлороформом в течение 20 мин,затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин,2 после чего вируссодержащую суспензию сливают в стерильные флаконы,инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 С в течение 24 часов, после чего вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, полученную надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4 пептон, 3 сахарозы и 1 желатин в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке. Штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О получают методом последовательных 15 пассажей через организм 2-3-суточных крольчат. В качестве исходного материала для адаптации к организму крольчат используют штамм вируса ящура типа О, выделенный со стенок афт с задних лапок больных ящуром морских свинок. Адаптацию его проводят следующим образом. Штамм вируса ящура в боксе взвешивают и растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, разводят 1100 фосфатно-буферным раствором рН-7,4. К суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1,0 см 3 суспензии и экстрагируют при температуре 20 в течение часа, перемешивают через 15 мин. Полученную 1-ную суспензию замораживают при минус 40 в течение 24 ч,оттаивают при температуре 20. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для адаптации к организму 2-3 суточных крольчат. Адаптация штамма вируса ящура. На каждый пассаж берут по 4 крольчат при двух контрольных. Крольчат заражают подкожно в первом пассаже 1 суспензией вируса ящура морских свинок в дозе 2,0 см 3. Зараженных и контрольных крольчат содержат в термальной комнате при температуре 2426. За крольчатами наблюдают до появления характерных (парезы и параличи конечностей,мышц туловища и шеи) клинических признаков заболевания ящуром. Затем их забивают и из их тушек готовят 10 суспензию и ее используют для проведения второго пассажа на крольчат в дозе 2,0 см 3. В последующих пассажах при регулярном развитии клинических признаков заболевания ящуром крольчат заражение проводят 10 суспензией, приготовленной из тушек крольчат предыдущих пассажей в дозе 1,0 см 3. При каждом пассаже вируса ящура из тушек крольчат, забитых в момент развития клинических признаков ящура, готовят антиген, который проверяют по РСК на наличие комплементсвязывающих свойств. Критерием для окончания последовательных пассажей вируса ящура служат регулярные развития клинических признаков ящура у крольчат через 1820 ч после заражения и высокая степень накопления комплементсвязывающих свойств в мышечной ткани. 25462 Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические свойства. Вирус ящура типа О относится к наиболее мелким вирусам животных. Размер вириона около 25 нм, вирус имеет сферическую (икосоэдрическую) форму, состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенной в белковую оболочку, состоящую главным образом из четырех белков 1 2, 3,4. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. РНК вируса состоит из 24 аденина, 28 цитозина,22 урацила. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, содержащей 18 аминокислот. Штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Адаптированный штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типак организму 2-3-суточных крольчат репродуцируется и накапливается в их организме титр 108,0 ЛД 50/0,1 мл (титр летальных доз,вызывающий 50 гибель мышат-сосунов). Антигенные свойства. При введении штамма вируса ящура типав организм животных (белые мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) он вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типапатогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок. Вирулентные свойства. Штамм(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типавирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном,аэрозольном и парентеральном заражении. Иммуногенные свойства. Штамм -0026(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типаиммуногенен в составе инактивированной вакцины. Реактогенные свойства. Штамм -0026(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типареактогениыми свойствами не обладает. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0026(КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типапри пассировании через организм 2-3-суточных крольчат сохраняются в течение 15 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О в нативном виде в консерванте (глицеринфизиологический раствор) при рН 7,4 не снижает биологической активности в течение 6 месяцев при температуре 41 С, 36 мес при минус 30 С. Изобретение осуществляется следующим образом. Для получения антигена используют штамм 0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О задепонированный в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт АО КазАгроИнновация МСХ РК). Пример 1. Адаптированным к организму крольчат штаммом -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О заражают группу крольчат. Заражение проводят введением подкожно 10 вируссодержащей суспензией в дозе 2,0 см 3,приготовленной из тушек крольчат последнего пассажа, приготовленной по выше описанной методике. В период выраженной клиники ящура крольчат забивают в стерильном боксе и их тушки используют при изготовлении антигена. Для этого тушки крольчат измельчают стерильной мясорубке и гомогенизируют в размельчителе ткани типа-302 в течение 10 мин. К гомогенату добавляют двойное количество фосфатно-буферный раствора с 7,4, чтобы получить 33 суспензию штамма -0026 (КазНИВИ) 03/11 вирус ящура типа О. Полученную суспензию добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1,0 см 3 суспензии и экстрагируют при температуре 15-18 в течение 2 ч, после чего дважды замораживают при температуре минус 40 в течение 24 часов и оттаивают при температуре 8. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин,надосадочную вируссодержащую суспензию отсасывают в стерильные флаконы, затем суспензию эмульгируют 5 хлороформом 20 мин,центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы,инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, после чего центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы. Пример 2. Проверка авирулентиости вирусной суспензии инактивированную вируссодержащую суспензию, взятную в асептических условиях из емкости, вводят подкожно в дозе 0,1 см 3 20 мышатам-сосунам. Мышат содержат с лактирующими матками. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Вируссодержащую суспензию считают авирулентной, если все привитые животные в течение 5 суток останутся клинически здоровыми. Пример 3. Определения активности и специфичности антигена в РСК. Активность и специфичность полученного антигена описанным способом была проверена в лабораторных условиях при постановке РСК со штаммоспецифическими положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предложенного антигена для серологических реакций при ящуре приведены в таблице. Из таблицы видно, что антиген против типа ,полученный описанным способом,с серопозитивными сыворотками в разведениях 18,116 дает положительные результаты при разведении антигена 132,а сывороткой разведенной 132, антиген активен в разведении 116, с серонегативными сыворотками дает 3 25462 отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакции при ящуре животных. В готовый антиген добавляют стабилизаторы,содержащие 4 пептона, 3 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110, тщательно перемешивают, расфасовывают в стерильные ампулы по 1,0 см 3, подвергают сублимационной сушке и помещают в холодильник при 4-8. Лиофилизацию антигенного материала начинают при -45. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4,5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 35-38. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, пока температура материала достигает 12-14, после чего обогрев переводят на температуре 25-30. Высушивание при температуре материала 23-25 проводят в течение 3-4 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают на карусельноколлектором аппарате при остаточном давлении 2025 Па. Полученный антиген представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Антиген может храниться в лиофилизированном виде 3 года, не теряя своего исходного титра. Предложенный способ получения антигена для серологических реакций при ящуре обеспечивает его высокую активность и специфичность, что позволяет повысить достоверность серологических реакций при ящуре. Таблица 1 Оценка активности и специфичности предлагаемого антигена штамма -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа О в РСК Разведение Разведение антигена сывороток 12 14 18 116 132 Положительный 18 Отрицательной 14 18 Контроль Антиген без сыворотки Сыворотка без антигена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена из штамма вируса ящура типадля серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение и растирание тушек,приготовление суспензии,экстрагирование,замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что используют штамм -0026 (КазНИВИ) 03/11 вируса ящура типа , который адаптируют к организму 2-3-суточных крольчат, забивают крольчат в период выраженной клиники ящура,тушки крольчат измельчают в мясорубке, затем гомогенезируют на размельчителе тканей и готовят 33 суспензию на фосфатно-буферном растворе,добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1,03 см суспензии и экстрагируют при температуре 15-18 в течение 2 часов, после чего дважды замораживают при температуре минус 40 в течение 24 часов и дефростируют при температуре 8, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин,полученную надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, после чего вируссодержащую суспензию эмульгируют 5 хлороформом в течение 20 мин,затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, после чего вируссодержащую суспензию сливают в стерильные флаконы, инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 часов, после чего вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин,полученную надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4 пептон, 3 сахарозы и 1 желатин в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке.