Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа Азия-1 для серологических реакций при ящуре животных

(51) 61 39/135 (2011.01) 61 37/02 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ физиологическом растворе,экстрагирование,замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, при этом используют штамм -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1, который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе, экстрагируют при температуре 18-20 в течение 2 ч, после чего трижды замораживают при температуре -20 в течение 24 ч и оттаивают при комнатной температуре,затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы, после чего эмульгируют 5-ным хлороформом 20 мин, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, инактивируют 0,03 ным раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, после чего суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную суспензию сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4-ный раствор пептона, 3-ный раствор сахарозы и 1-ный раствор желатина, после чего тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы или флаконы по 1,0 см 3,подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт. Предложенный способ получения антигена для серологических реакций при ящуре обеспечивает его высокую активность и специфичность, что позволят повысить достоверность серологических реакций при ящуре.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна Калисынов Берик Серикбаевич Есходжаев Олжас Умирзахович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ ШТАММА ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА АЗИЯ-1 ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ЯЩУРЕ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики ящура и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при ящуре животных. Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа Азия-1 для серологической реакции при ящуре животных включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение в мясорубке, затем в микроизмельчителе, приготовление суспензии на 25409 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики ящура и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Известен способ получения антигена из штамма вируса ящура типа Азия-1 для серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат,забивание больных крольчат, измельчении в мясорубке,затем в микроизмельчителе,приготовление суспензии на физиологическом растворе, экстрагирование, замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование,центрифугирование и получение надосадочной жидкости (Салажов Е.П. Ветеринарные препараты. М. Колос, 1981,-с. 66-73). Однако такой антиген не обладает достаточной активностью для выявления антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Задачей изобретения является разработка способа получения высокоактивного стабильного антигена типа Азия-1, позволяющего выявлять антитела в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром,в качестве контроля типоспецифичности гипериммунной сыворотки к вирусу ящура типа Азия-1. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными свойствами для применения его в серологических реакциях при ящуре животных. Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа Азия-1 для серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение в мясорубке, затем в микроизмельчителе, приготовление суспензии на физиологическом растворе,экстрагирование,замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, при этом используют штамм-0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1, который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе, экстрагируют при температуре 18-20 С в течение 2 ч, после чего трижды замораживают при температуре -20 в течение 24 ч и оттаивают при комнатной температуре,затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы, после чего эмульгируют 5-ным хлороформом 20 мин, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, инактивируют 0,03 ным раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, после чего суспензию 2 центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин,затем надосадочную суспензию сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4-ный раствор пептона, 3-ный раствор сахарозы и 1-ный раствор желатина, после чего тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы или флаконы по 1,0 см 3,подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт. Штамм -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 проводят методом последовательных не более 12 пассажей через организм 2-3 суточных крольчат, афтозного вируса ящура, выделенного от больного ящуром крупного рогатого скота. В качестве исходного материала для адаптации к организму крольчат используют штамм вируса ящура типа Азия-1, выделенного со стенок афт с поверхности слизистого языка больного крупного рогатого скота. Адаптацию его проводят следующим образом. Штамм вируса ящура в боксе взвешивают и растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, разводят в соотношении 1100 забуферном физиологическом раствором, рН-7,2. В суспензиюдобавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД па 1,0 см 3 суспензии и экстрагируют при температуре 18-20 в течение часа, перемешивают через 20 мин. Полученную 1-ную суспензию замораживают при минус 20 в течение 24 ч,оттаивают при температуре 18-20 С. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для адаптации к организму 2-3 суточных крольчат. Адаптация штамма вируса ящура. Крольчат в возрасте 2-3 суток заражают подкожно в первом пассаже 1 суспензией афтозного вируса ящура крупного рогатого скота в дозе 2,0 см 3. После заражения их содержат в термальной комнате при температуре 28-30. За крольчатами наблюдают до появления характерных(парезы и параличи конечностей, мышцы туловища и шеи) клинических признаков заболевания ящуром(не более 36-40 ч после заражения). Затем их забивают и из их тушек готовят 10-ную суспензию и ее используют для проведения второго пассажа на крольчат в дозе 2,0 см 3. В последующих пассажах при регулярном развитии клинических признаков заболевания ящуром крольчат заражение проводят 10-ной суспензией, приготовленной из тушек крольчат предыдущих пассажей в дозе 1,0 см 3. При каждом пассаже вируса ящура из тушек крольчат, забитых в агональном состоянии, готовят антиген, который проверяют по РСК на наличие комплементсвязывающих свойств. Критерием для окончания последовательных пассажей вируса ящура является регулярное развитие клинических признаков ящура у крольчат через 18-22 ч после заражения и высокая степень накопления комплементсвязывающих свойств в мышечной ткани. Изобретение осуществляется следующим образом. 25409 Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические свойства. Вирус ящура типа Азия-1 относится к наиболее мелким вирусам животных. Размер вириона около 25 нм, вирус имеет сферическую (иксоэдрическую) форму,состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку,состоящую главным образом из четырех белков 1,2, 3, 4. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. РНК вируса состоит из 24 аденина,28 цитозина, 22 урацила. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, содержит 18 аминокислот. Штамм -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя ящура рода афто-вирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Штамм -0027(КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1,адаптированный к организму 2-3 суточных крольчат репродуцируется и накапливается в их организме в титре 108,5 ЛД 0,1/см 3 (титр летальных доз,вызывающий 50 гибель мышат-сосунов). Антигенные свойства. При введении штамма-0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия 1 в организм животных (белые мыши, морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) возникает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм(КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 патогенен для парнокопытных животных,новорожденных мышат, морских свинок. Вирулентные свойства. Штамм(КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении. Реактогенные свойства. Штамм -0027(КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 реактогенными свойствами не обладает. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойств штамма -0027(КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 при пассировании через организм 2-3 суточных крольчат сохраняются в течение 12 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 в виде тушки крольчат в консерванте физиологический раствор) при рН 7,4 не снижает биологической активности в течение 6 месяцев при температуре 41, 36 мес при минус 40 С. Для получения антигена используют штамм 0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 задепонированный в лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт АО КазАгроИнновация МСХ РК. Пример. Адаптированным к организму крольчат штаммом -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 заражают группу крольчат. Заражения проводят 10-ной вируссодержащей суспензией, приготовленной из тушек крольчат последнего пассажа по выше описанной методике подкожно, в дозе 2,0 см 3. В период выраженной клиники ящура крольчат забивают в стерильном боксе и их тушки используют при изготовлении антигена. Для этого тушки крольчат измельчают стерильными ножницами и гомогенизируют в размельчителе ткани типа -302 в течение 5-8 мин. К гомогенату добавляют двойное количество забуферного физиологического раствора с рН 7,4,чтобы получить 33 суспензию вируса ящура типа Азия-1 штамма -0027 (КазНИВИ). Полученную 33 суспензию экстрагируют в течение 2 ч при комнатной температуре,периодически перемешивают. Затем трижды замораживают при температуре -20 в течение 24 ч, оттаивают при комнатной температуре и центрифугируют при 5000 об/мин 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и эмульгируют 5-ным хлороформом 20 мин. После чего суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин,инактивируют 0,03-ным раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч. После чего суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную суспензию сливают в стерильные флаконы. Приготовленный антиген проверяют на авирулентность на мышатах-сосунах, активность с гомологичной сывороткой и специфичность с сыворотками других типов. Проверка антигена на авирулентность. С этой целью антиген вводят подкожно в дозе 0,1 см 3 20 мышатам-сосунам 3-4 суточного возраста. Мышат содержат совместно с лактирующими матками. Наблюдения ведут в течение 5 суток. Антиген считают авирулентным, если все привитые животные в течение 5 суток останутся клинически здоровыми. Определение серологической активности и специфичности антигена в РСК. Активность и специфичность полученного антигена проверены в лабораторных условиях при постановке РСК с типоспецифическими положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предложенного антигена для серологических реакций при ящуре приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген против типа Азия-1, полученный описанным способом, с серопозитивными сыворотками в разведениях 18,116 дает положительные результаты при разведении антигена 132, с серонегативными сыворотками дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакций при выявлении ящура животных. 25409 В готовый антиген добавляют стабилизатор,содержащий 4-ный раствор пептона, 3-ный сахарозы и 1-ный раствор желатина в соотношении 110, тщательно перемешивают,расфасовывают в стерильные ампулы или флаконы по 1,0 см 3, подвергают сублимационной сушке и помещают в холодильник при 4-8 С. Перед сушкой антигены замораживают в ампулах, помещенных в кассеты или на противни, в низкотемпературных камерах при температуре от минус 40 до минус 60. Средняя скорость замораживания антигена перед сушкой не более 0,5 С в 1 мин. До переноса в сушильную камеру кассет или противни с замороженным препаратом включают холодильную машину, чтобы охладить конденсатор до минус 40 - 50 С. Полки сублиматора охлаждаются до минус 20 С - 30 С. Замороженный препарат быстро переносят в сушильную камеру,герметизируют ее и включают вакуумный насос. Лиофилизацию антигенного материала начинают при - 45 С. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4,5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 35-40. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигает 0-6 С, после чего температуру полки понижают до 25-30. Высушивание материала при температуре 23-25 проводят в течение 3-4 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают под вакуумом. Полученный антиген представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Антиген может храниться в лиофилизированном виде 3 года, не теряя своего исходного титра. Предложенный способ обеспечивает получение высокоактивного, специфического антигена типа Азия-1,повышающего достоверность серологических реакций при ящуре животных. Таблица 1 Оценка активности и специфичности предлагаемого антигена штамма -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1 в РСК Разведение сывороток Положительная сыворотка 116 Положительная сыворотка 132 Отрицательная сыворотка 14 Контроль Антиген без сыворотки Сыворотки без антигена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа Азия-1 для серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение в мясорубке, затем в микроизмельчителе, приготовление суспензии на физиологическом растворе,экстрагирование,замораживание и оттаивание, концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что при этом используют штамм -0027 (КазНИВИ) 02/11 вируса ящура типа Азия-1, который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат,забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе, экстрагируют при температуре 18-20 в течение 2 ч, после чего трижды замораживают при температуре -20 в течение 24 ч и оттаивают при комнатной температуре, затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы, после чего эмульгируют 5-ным хлороформом 20 мин,затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, инактивируют 0,03-ным раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, после чего суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, затем надосадочную суспензию сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду, включающую 4-ный раствор пептона, 3-ный раствор сахарозы и 1 ный растров желатина, после чего тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы или флаконы по 1,0 см 3, подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт.