Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа А для серологических реакций при ящуре животных

(51) 61 39/135 (2011.01) 12 7/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ящура к организму крольчат, забивание их,измельчение и растирание тушек, приготовление суспензии, экстрагирование ее, замораживание и оттаивание, инактивирование в водяной бане при температуре 58 в течение 2 ч, центрифугирование и отделение надосадочной жидкости, при этом используют штамм -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа , который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе, экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего трехкратно замораживают при -20 в течение 24 ч и оттаивают при температуре 4-8, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную вируссодержащую суспензию сливают в стерильные флаконы, после чего эмульгировать 5 хлороформом 20 мин, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течении 15 мин,инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин,после чего надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4 пептона, 3 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке. Предложенный способ получения антигена для серологических реакций при ящуре обеспечивает его высокую активность и специфичность, что позволяет повысить достоверность серологических реакций при ящуре.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна Калисынов Берик Серикбаевич Есходжаев Олжас Умирзахович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Филлипович С.М., Савин В.К. Получение типовых и вариантных антигенов для РСК при ящуре // Сб. науч. тр. КазНИВИ, 1966, т. 12, с. 123127(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ ШТАММА ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА А ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ ПРИ ЯЩУРЕ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики ящура и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными для применения его в серологических реакциях при ящуре и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа А для серологических реакций при ящуре животных включающий адаптацию вируса 25408 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения диагностических препаратов и может найти применение в ветеринарной практике для диагностики ящура и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Известен способ получения антигена из штамма вируса ящура типадля серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчение и растирание тушек,приготовление суспензии,экстрагирование,замораживание и дефростацию, инактивирование в водяной бане при температуре 58 в течение 2-х часов,центрифугирование и отделение надосадочной жидкости (Филлипович С.М.,Савин В.К. Получение типовых и вариантных антигенов для РСК при ящуре // Сб. науч. тр. КазНИВИ, 1966, т. 12 с. 123-127). Однако такой антиген не обладает достаточной активностью и специфичностью. Задачей изобретения является разработка способа получения антигена для серологических реакций при ящуре животных, обладающего достаточной активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного антигена со стабильными для применения его в серологических реакциях при ящуре и выявления антител в сыворотке крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена из штамма вируса ящура типадля серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание их,измельчение и растирание тушек, приготовление суспензии, экстрагирование ее, замораживание и оттаивание, инактивирование в водяной бане при температуре 58 в течение 2 ч, центрифугирование и отделение надосадочной жидкости, при этом используют штамм -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа , который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе, экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего трехкратно замораживают при -20 в течение 24 ч и оттаивают при температуре 4-8, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную вируссодержащую суспензию сливают в стерильные флаконы, после чего эмульгировать 5 хлороформом 20 мин, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течении 15 мин,инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин,после чего надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду,включающую 4 пептона, 3 сахарозы и 1 2 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке. Штамм -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа А проводят методом последовательных не более 15 пассажей через организм 2-3 суточных крольчат, афтозного вируса ящура, выделенного от больного ящура крупного рогатого скота. В качестве исходного материала для адаптации к организму крольчат используют штамм афтозного вируса ящура типакрупного рогатого скота. Афты должны быть свежими,плотной консистенции, не издающими гнилостного запаха. Адаптацию его проводят следующим образом. Штамм вируса ящура в боксе растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, разводят 1100 забуферным физиологическим раствором 7,2-7,4. К суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1 см 3 суспензии и экстрагируют при комнатной температуре в течение часа,перемешивают через 15-20 минут. Полученную 1 ную суспензию двукратно замораживают при -20 С в течение 24 ч, оттаивают при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин или 10 мин при 6000 об/мин. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для адаптации к организму 2-3 суточных крольчат. Адаптация штамма вируса ящура. На каждый пассаж берут по 6 крольчат, 2 из них не заражают(контроль). Крольчат заражают подкожно в первом пассаже 1 суспензией афтозного вируса ящура крупного рогатого скота в дозе 2,0 см 3. Зараженных и контрольных крольчат содержат в эмалированной посуде с гигроскопической подстилкой в термальной комнате с температурой 24-26. За крольчатами наблюдают до появления характерных(парезы и параличи конечностей и мышцы туловища, шеи) клинических признаков заболевания ящуром. Затем их забивают и из тканей готовят 10 суспензию и используют ее для проведения второго пассажа на крольчатах в дозе 2,0 см 3. Для последующих пассажей используют 10 вируссодержащую суспензию, приготовленную из тушек крольчат предыдущих пассажей. При каждом пассаже вируса ящура из тушек крольчат, забитых в момент развития клинических признаков ящура, выделяют антиген, который проверяют по РСК на наличие комплементсвязывающих свойств. Критерием для окончания последовательных пассажей вируса ящура служит регулярное развитие клинических признаков ящура у крольчат через 1822 ч после заражения и высокая степень накопления комплементсвязывающих свойств в мышечной ткани. Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические свойства. Вирус ящура типа А относится к наиболее мелким вирусам животных,размер вириона около 25 нм, вирус имеет 25408 сферическую (икосоэдрическую) форму, состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенной в белковую оболочку, состоящую главным образом из четырех белков 1, 2, 3,4. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. РНК вируса состоит из 24 гуанина, 26 аденина,28 цитозина, 22 урацила. Молекула вирусного белка состоит из 5 полипептидных цепей, в нем содержится 18 аминокислот. Штамм -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типаобладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Адаптированный штамм -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типак организму 2-3 суточных крольчат репродуцируется и накапливается в их организме в титре 108,5 ЛД 50/0,1 см 3 (титр летальных доз,вызывающих 50 гибель мышат-сосунов). Антигенные свойства. Введение штамма вируса яшура типа А в организм животных (белые мыши,морские свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Патогенные свойства. Штамм(КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа А патогенен для парнокопытных животных, неворожденных мышат, морских свинок. Вирулентные свойства. Штамм(КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа А вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном,аэрозольном и парентеральном заражении. Иммуногенные свойства. Штамм -0024(КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типаиммуногенен в составе инактивированной вакцины. Реактогенные свойства. Штамм -0024(КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типареактогенными свойствами не обладает. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма -0024(КазНИВИ) вируса ящура типапри пассировании через организм 2-3 суточных крольчат сохраняются в течение 15 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм вируса ящура типа А в нативном виде в консерванте(глицерин физиологический раствор аа) при 7,2-7,4 не снижает биологической активности в течение 6 мес при температуре 41, 24 мес - при минус 20. Изобретение осуществляется следующим образом. Для получения антигена используют штамм 0024 (КазНИВИ) 01 /11 вируса ящура типа ,задепонировамный в лаборатории, по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт АО КазАгроИнновация МСХ РК. Пример. Адаптированным к организму крольчат штаммом -0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типазаражают группу крольчат. Заражение проводят 10 вируссодержащей суспензией,приготовленной из тушек крольчат последнего пассажа по вышеописанной методике, подкожно в дозе 2,0 см 3. В период выраженной клиники ящура крольчат забивают в стерильных боксах и их тушки используют для приготовления антигена. Для этого тушки крольчат измельчают на мясорубке и гомогенизируют в размельчителе тканей типа 302 в течение 5 мин. К гомогенату добавляют двойное количество забуферного физиологического раствора с 7,4, чтобы получить 33-ную суспензию вируса ящура штамма -0024(КазНИВИ) вируса ящура типа А. К суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин на 1,0 см 3 суспензии экстрагируют в течение 2 ч при комнатной температуре,периодически перемешивают. Затем трижды замораживают при 20 в течение 24 ч, размораживают при температуре 4-8 и центрифугируют при 3000 об/мин 30 минут. Надосадочную жидкость отделяют в стерильную посуду и эмульгируют 5-ным хлороформом 20 мин, затем центрифугируют при 5000 об/мин в течении 15 мин, инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 С в течение 24 ч, затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин, после чего надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы. Авирулентность приготовленного антигена проверяют па мышатах-сосунах,активность с гомологической сывороткой, а специфичность с сыворотками других типов. Проверка антигена на авирулентность. Приготовленный антиген вводят в дозе 0,1 см 3 20 мышатам сосунам 3-4 суточного возраста. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Антиген считают авирулентным, если все привитые мышата-сосуны в течение 5 суток останутся клинически здоровыми. Активность и специфичность полученного антигена была проверена в лабораторных условиях при постановке РСК с штаммоспецифическими положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предлагаемого антигена для серологических реакции при диагностике ящура животных приведены в таблице. Из таблицы видно, что антиген, полученный описанным способом,с серопозитивными сыворотками в разведениях 116 и 132 дает положительные результаты против типапри разведении антигена 132, с серонегагивными дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакции при диагностике ящура животных. В готовый антиген добавляют стабилизатор,содержащий 4 пептона, 3 сахарозы, 1 желатина в соотношении 110, тщательно перемешивают, расфасовывают в стерильные ампулы но 1,0 см 3, подвергают сублимационной сушке и помещают в холодильник при 4. Лиофилизацию антигенного материала начинают при -40 С. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в 3 25408 пределах 5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 35-40 С. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигает 10-12 С, после чего обогрев переводят на температуру 25-30 С. Высушивание при температуре материала 23-25 С проводят в течение 4-5 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают на карусельноколлекторном аппарате при остаточном давлении 20-25 Па. Полученный антиген представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Таблица Оценка активности и специфичности антигена штамма -0024 (КазНИВИ) вируса ящура типа А в РСК Разведение сывороток Положительной Отрицательной Контроль Антиген без сыворотки Сыворотка без антигена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена из штамма вируса ящура типа А для серологических реакций при ящуре животных, включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание их,измельчение и растирание тушек, приготовление суспензии, экстрагирование ее, замораживание и оттаивание, инактивирование в водяной бане при температуре 58 в течение 2 ч, центрифугирование и отделение надосадочной жидкости,отличающийся тем, что используют штамм 0024 (КазНИВИ) 01/11 вируса ящура типа А,который адаптируют к организму 2-3 суточных крольчат, забивают их в период выраженной клиники ящура и из тушек готовят 33 суспензию на забуферном физиологическом растворе,экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего трехкратно замораживают при -20 С в течение 24 ч и дефростируют при температуре 48, затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, после чего вируссодержащую суспензию эмульгируют 5 хлороформом в течение 20 мин,затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин,после чего инактивируют 0,03 раствором формальдегида при температуре 37 в течение 24 ч, затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин, после чего надосадочную жидкость сливают в стерильные флаконы и добавляют защитную среду, включающую 4 пептона, 3 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1,0 см 3 и подвергают сублимационной сушке.