Способ получения антигена типа А вируса ящура для серологических реакций

(51) 61 39/135 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антител в сыворотках крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена вируса ящура типа А, включает культивирование вируса ящура штамма А Ак-2000, на перевиваемой линии клеток ВНК 21/13, сбор вирусной массы, замораживание и оттаивание, центрифугирование, инактивацию,концентрирование полиэтиленгликолем, фасовку,лиофильную сушку и упаковку. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокоактивного и специфичного культурального антигена для применения его в серологических реакциях при ящуре.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ТИПА А ВИРУСА ЯЩУРА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ(57) Изооретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для диагностики ящура и выявления 20492 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для диагностики ящура и выявления антител в сыворотках крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Известен способ получения антигена типа А для серологических реакций при ящуре животных,включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчении, растирание в ступке, приготовление суспензии на физиологическом растворе,экстрагирование, замораживание и оттаивание,концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости Салажов Е.П. Ветеринарные препараты, М. Колос, 1981, с.66-73. Однако такой антиген не позволяет выявлять возбудителя ящура и не обладает достаточной активностью для выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Задачей изобретения является разработка способа получения антигена вируса ящура типа А с применением культуры клеток ВНК-21/13 обладающего высокой активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокоактивного и специфичного культурального антигена для применения его в серологических реакциях при диагностике ящура. Способ получения антигена вируса ящура типа А, включающем культивирование вируса ящура типа А на перевиваемой линии клеток ВНК-21/13, с использованием штамма вируса ящура типа А АК 2000, который адаптируют путем последовательных пассажей к культуре клеток ВНК 21/13,в период максимального развития цитопатических изменений проводят сбор вирусной массы, после чего однократно замораживают при температуре - 20 С в течение 24 ч и оттаивают при температуре 22 С, затем вирусную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03 в течение 24 ч при температуре 26 С, концентрируют полиэтиленгликолем в конечной концентрации 8 и добавляют защитную среду, включающую 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1 см 3, подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт. Селекция штамма. Селекцию штамма вируса ящура АК-2000 типа А проводят методом последовательных 18 пассажей на культуре клеток ВНК-21/13. В качестве исходного материала для адаптации к организму крольчат используют штамм вируса ящура типа А, в виде стенок афт из задних лапок 2 больных ящуром морских свинок. Лапки морских свинок в боксе взвешивают и растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, разводят 1100 фосфатно-буферным раствором рН-7,4. К тканевой суспензии добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1 см 3 суспензии. Полученную 1-ую суспензию замораживают при минус 40 С в течение 24 ч, оттаивают при температуре 20 С. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для заражения культур клеток. Адаптацию возбудителя ящура к культуре клеток проводят следующим образом. На каждый пассаж берут по 4-5 матрасов с культурой клеток ВНК-21/13 при двух контрольных. Для инфицирования используют клеток с плотным монослоем без каких-либо деструктивных изменений. До инфицирования культур клеток монослой двукратно промывают подогретой до 37 С раствором Хенкса. В первом пассаже культуру клеток заражают 1 тканевой суспензией вируса ящура в объеме 2 см 3 и ставят на контакт на 1 час. После истечения времени контакта содержимое сосудов удаляют и вносят свежую порцию поддерживающей питательной среды Игла-МЕМ. Зараженных и контрольных культур клеток инкубируют при температуре 37 С с ежедневной микроскопией монослоя. При максимальном развитии характерных цитопатических изменений в монослое, сосуды с клетками замораживают при температуре минус 20 С и размораживают при температуре 22 С. Затем их объединяют в одну стерильную посуду и среднюю пробу вирусной суспензии используют для проведения второго пассажа. Во втором пассаже также используют культуру клеток ВНК-21/13 с плотным монослоем без каких-либо деструктивных изменений, их заражают кудьтуральным вирусом в объеме 2 см 3. В последующих пассажах при регулярном развитии характерных цитопатичсеких изменении проводят сбор вирусной массы и объединенную среднюю пробу применяют для заражения следующей партии перевиваемой линии клеток ВНК-21/13. При каждом пассаже вируса ящура после замораживания и размораживания, готовят антиген,который проверяют в реакции связывания комплемента(РСК) на наличие комплементсвязывающего антигена. Критерием для окончания последовательных пассажей вируса ящура служат регулярное развитие характерных цитопатичсеких изменений вируса ящура в монослое через 48 ч после заражения и высокая степень накопления,комплементсвязывающего антигена. Изобретение осуществляется следующим образом. Для получения антигена используют штамм АК-2000 вируса ящура типа А. Морфологические свойства. Вирус ящура типа А относится к наиболее мелким вирусам животных. Размер вириона около 25 нм, вирус имеет 20492 сферический (икосоэдрический) форму, состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенную в белковую оболочку, состоящей главным образом из четырех белков 1 2, 3,4,. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. РНК вируса состоит из 24 аденита,28 цитозина, 22 уроцила. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, в нем содержится 18 аминокислот. Штамм АК-2000 вируса ящура типа А обладает морфологическими признаками,свойственными для возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Штамм АК-2000 вируса ящура типа А на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13 репродуцируется и накапливается в титре 1085 ТЦД 5 о/См 3 Антигенные свойства. При введении штамма АК-2000 вируса ящура типа А в организм животных (белые мыши, морские свинки, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойств штамма АК 2000 вируса ящура типа А при пассировании на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13,сохраняются в течение 18 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм АК-2000 вируса ящура типа А в нативном виде при рН 7,4 не снижает биологической активности в течение 35 дней при температуре 41 С, 36 мес. - при минус 30 С. Пример 1. Адаптированным к культуре клеток штаммом АК-2000 вируса ящура типа А,заражают культуру клеток ВНК-21/13. Инфицирования проводят культуральной вируссодержащей суспензией, приготовленной из последнего пассажа, полученный по выше описанной методике в объеме 2 см 3. В период максимальной развитии характерных цитопатических изменении сосуды замораживают при температуре минус 20 С в течение 24 часов и размораживают при 22 С. Затем в стерильном боксе вирусную суспензию объединяют в стерильную посуду и используют при изготовлении антигена. Для этого вирусную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03-та в течение 24 ч при температуре 26 С и концентрируют десятикратно 8 полиэтиленгликолем. Пример 2. Определения серологической активности и специфичности антигена в РСК. Активность и специфичность антигена полученного описанным способом был проверен в лабораторных условиях при постановке РСК с типоспецифическими положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предлагаемого антигена для серологических реакций при ящуре приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген вируса ящура типа А полученный описанным способом, с серопозитивными сыворотками в разведениях 14,18 и 116 дает положительные результаты при разведении антигена 164, с серо-негативными сыворотками дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакции при ящуре животных. В готовый антиген добавляют стабилизирующую среду, состоящий из 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110, тщательно перемешивают, расфасовывают в стерильные ампулы по 1 см 3, подвергают сублимационной сушке и помешают в холодильник при 4 -8 С. Лиофилизацию антигенного материала начинают при температуре - 45 С. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4,5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 35-38 С. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигает 12-14 С, после чего обогрев переводят на температуру 25-30 С. Высушивание при температуре материала 23-25 С проводят в течение 3-4 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают на карусельно коллектором аппарате при остаточном давлении 2025 Па. Полученный антиген представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Антиген может храниться в лизофилизированном виде 3 года, не теряя своего исходного титра.Таким образом, изготовление антигена для серологических реакций при ящуре обеспечивает (по сравнению с известным антигеном) высокую активность и специфичность,что позволяет повысить достоверность результатов серологических реакций при ящуре. 20492 Таблица 1 Оценка активности и специфичности предлагаемого антигена типа А штамма вируса ящура АК-2000 в РСК Разведение сывороток Разведение антигена 12 14 18 116 132 164 1128 Положительной 14 Отрицательной 14 18 Контроль Антиген без сыворотки Сыворотка без антигена ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена типа А для серологических реакций при ящуре животных,включающий получение вирусной массы,замораживание и оттаивание, центрифугирование,концентрирование и инактивирование,отличающийся тем, что используют штамм вируса типа А АК-2000, который адаптируют путем последовательных пассажей к культуре клеток ВНК 21/13,в период максимального развития цитопатических изменений проводят сбор вирусной массы, замораживание .осуществляют однократно при температуре - 20 С в течение 24 ч, оттаивание при температуре 22 С,центрифугирование осуществляют при 5000 об/мин в течение 30 мин,вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03 в течение 24 ч при температуре 26 С,концентрирование осуществляют полиэтиленгликолем в конечной концентрации 8 с последующим добавлением защитной среды,включающей 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно,тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы и подвергают сублимационной сушке.