Способ получения антигена типа О вируса ящура для серологических реакций

(51) 61 39/135 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антител в сыворотках крови вакцинированных,переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Способ получения антигена вируса ящура типа О, включает культивирование вируса ящура штамма О Д-05, на перевиваемой линии клеток ВНК 21/13, сбор вирусной массы, замораживание и оттаивание, центрифугирование, инактивацию, концентрирование полиэтиленгликолем,фасовку,лиофильную сушку и упаковку. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокоактивного и специфичного культурального антигена для применения его в серологических реакциях при ящуре.(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович Мададов Малакша Фашанович Хайруллаева Куралай Амангельдиевна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ТИПА О ВИРУСА ЯЩУРА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для диагностики ящура и выявления 20493 Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано для диагностики ящура и выявления антител в сыворотках крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Известен способ получения антигена типа О для серологических реакций при ящуре животных,включающий адаптацию вируса ящура к организму крольчат, забивание больных крольчат, измельчении, растирание в ступке, приготовление суспензии на физиологическом растворе,экстрагирование, замораживание и оттаивание,концентрирование и инактивирование, центрифугирование и получение надосадочной жидкости Салажов Е.П. Ветеринарные препараты, М. Колос, 1981, С. 66-73. Однако такой антиген не позволяет выявлять возбудителя ящура и не обладает достаточной активностью для выявления антител в сыворотке крови вакцинированных, переболевших или подозреваемых в переболевании животных ящуром. Задачей изобретения является разработка способа получения антигена вируса ящура типа О с применением культуры - клеток ВНК-21/13 обладающего достаточной активностью и специфичностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокоактивного культурального антигена со стабильно высокими иммунобиологическими свойствами для применения его в серологических реакциях при ящуре. Способе получения антигена вируса ящура типа О, включающем культивирование вируса ящура типа О на перевиваемой линии клеток ВНК-21/13, с использованием штамма вируса ящура типа О Д 05, который адаптируют путем последовательных пассажей к культуре клеток ВНК-21/13, в период максимального развития цитопатических изменений проводят сбор вирусной массы, после чего однократно замораживают при температуре - 20 С в течение 24 ч и оттаивают при температуре 22 С,затем вирусную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03 в течение 24 ч при температуре 26 С, концентрируют полиэтиленгликолем в конечной концентрации 8 и добавляют защитную среду, включающую 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно, затем тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы по 1 см, подвергают сублимационной сушке и получают целевой продукт. Селекция штамма. Селекцию штамма вируса ящура Д-05 типа О проводят методом последовательных 15 пассажей на культуре клеток ВНК 21/13. В качестве исходного материала для адаптации к организму крольчат используют штамм вируса ящура типа О, в виде стенок афт из задних лапок 2 больных ящуром морских свинок. Лапки морских свинок в боксе взвешивают и растирают стерильно в фарфоровой ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы, разводят 1100 фосфатно-буферным раствором рН-7,4. К суспензию добавляют пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД на 1 см 3 суспензии. Полученную 1-ую суспензию замораживают при минус 40 С в течение 24 ч,оттаивают при температуре 20 С. Затем суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную вируссодержащую суспензию используют для заражения культур клеток. Адаптацию возбудителя ящура к культуре клеток проводят следующим образом. На каждый пассаж берут по 5 матрасов с культурой клеток ВНК-21/13 при двух контрольных. Для эксперимента используют клеток с плотным монослоем без каких-либо деструктивных изменений. До инфицирования культур клеток монослой двукратно промывают подогретой до 37 С раствором Хенкса. В первом пассаже культуру клеток заражают 1 тканевой суспензией вируса ящура в дозе 2 см 3 и ставят на контакт на 1 час. После истечения времени контакта содержимое сосудов удаляют и вносят свежую порцию поддерживающей питательной среды Игла. Зараженных и контрольных культур клеток инкубируют при температуре 37 С с ежедневной микроскопией монослоя. При максимальном развитии характерных цитопатических изменений в монослое сосуды с клетками замораживают при температуре минус 20 С и размораживают при температуре 22 С. Затем их объединяют в одну стерильную посуду и среднюю пробу вирусной суспензии используют для проведения второго пассажа. Во втором пассаже также используют культуру клеток ВНК-21/13 с плотным монослоем без каких-либо деструктивных изменений, их заражают культуральным вирусом в дозе 2 см 3. В последующих пассажах при регулярном развитии характерных цитопатичсеких изменении проводят сбор вирусной массы и объединенную среднюю пробу применяют для заражения следующей партии перевиваемой линии клеток ВНК-21/13. При каждом пассаже вируса ящура после замораживания и размораживания, готовят антиген,который проверяют в реакции связывания комплемента (РСК) на наличие комплементсвязывающего антигена. Критерием для окончания последовательных пассажей вируса ящура служат регулярное развитие характерных цитопатичсеких изменений вируса ящура в монослое через 48 ч после заражения и высокая степень накопления,комплементсвязывающего антигена. Изобретение осуществляется следующим образом. Штамм характеризуется следующими признаками. Морфологические свойства. Вирус ящура типа О относится к наиболее мелким вирусом животных. Размер вириона около 25 нм, вирус имеет сферический (икосоэдрический) форму, состоит из 20493 одноцепочечной линейной молекулы РНК,заключенную в белковую оболочку, состоящей главным образом из четырех белков 1 2, 3,4,. Вирус содержит 31,5 РНК и 68,5 протеинов. РНК вируса состоит из 24 аденита,28 цитозина, 22 уроцила. Молекула белка состоит из 5 полипептидных цепей, в нем содержится 18 аминокислот. Штамм Д-05 вируса ящура типа О обладает морфологическими признаками, свойственными для возбудителя ящура рода афтовирусов семейства пикорновирусов. Культуральные свойства. Штамм Д-05 вируса ящура типа О на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13 репродуцируется и накапливается Антигенные свойства. При введении штамма Д 05 вируса ящура типа О в организм животных(белые мыши, морские свинки, крупный рогатый скот) вызывает образование вируснейтрализующих,комплементсвязывающих и преципитирующих антител. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойств штамма Д-05 вируса ящура типа О при пассировании на перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13, сохраняются в течение 12 пассажей (срок наблюдения). Сохраняемость. Штамм Д-05 вируса ящура типа О в нативном виде при рН 7,4 не снижает биологической активности в течение 30 дней при температуре 41 С, 36 мес - при минус 30 С. Пример 1. Адаптированным к культуре клеток штаммом Д-05 вируса ящура типа О, заражают культуру клеток ВНК-21/13. Инфицирования проводят культуральной вируссодержащей суспензией, приготовленной из последнего пассажа,полученной по выше описанной методике в объеме 2 см 3. В период максимальной развитии характерных цитопатических изменении сосуды замораживают при температуре минус 20 С в течение 24 часов и размораживают при 22 С. Затем в стерильном боксе вирусную суспензию объединяют в стерильную посуду и используют при изготовлении антигена. Для этого вирусную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин. надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы, затем вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03-та в течение 24 ч при температуре 26 С и концентрируют двадцатикратно 8 полиэтиленгликолем. Пример 2. Определения серологической активности и специфичности антигена в РСК. Активность и специфичность антигена полученного описанным способом был проверен в лабораторных условиях при постановке РСК с типоспецифическими положительными и отрицательными сыворотками. Результаты оценки активности и специфичности предлагаемого антигена для серологических реакций при ящуре приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген вируса типа О полученный описанным способом, с серопозитивными сыворотками в разведениях 14, 18 и 116 дает положительные результаты при разведении антигена 132, с серо-негативными сыворотками дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволяет использовать его в качестве антигена для серологических реакции при ящуре животных. В готовый антиген добавляют стабилизирующую среду, состоящий из 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110, тщательно перемешивают, расфасовывают в стерильные ампулы по 1 см 3, подвергают сублимационной сушке и помешают в холодильник при 4-8 С. Лиофилизацию антигенного материала начинают при - 45 С. Величину вакуума в камере сублимационного аппарата устанавливают в пределах 4,5-7,5 Па. Конечная температура полок аппарата в процессе высушивания 35-38 С. Высушивание при подогреве полок до указанной температуры осуществляют до того момента, когда температура материала достигает 12-14 С, после чего обогрев переводят на температуре 25-30 С. Высушивание при температуре материала 23-25 С проводят в течение 3-4 часов. Ампулы с высушенным антигеном запаивают на карусельно коллектором аппарате при остаточном давлении 20-25 Па. Полученный антиген представляет гомогенную массу желтовато-белого цвета без посторонней примеси. Антиген может храниться в лизофилизированном виде 3 года, не теряя своего исходного титра. Таким образом, изготовление антигена для серологических реакций при ящуре обеспечивает(по сравнению с известным антигеном) высокую активность и специфичность, что позволяет повысить достоверность результатов серологических реакции при ящуре. Таблица 1 Оценка активности и специфичности предлагаемого антигена типа О штамма вируса ящура Д-05 в РСК Разведение сыворотк Разведение антигена 12 14 18 116 132 Положительной 14 18 116 Отрицательной 14 18 Контроль Антиген без сыворотки Сыворотка без антигена 20493 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена типа О для серологических реакций при ящуре животных,включающий получение вирусной массы,замораживание и оттаивание, центрифугирование,концентрирование и инактивирование, отличающийся тем, что используют штамм вируса типа О Д-05, который адаптируют путем последовательных пассажей к культуре клеток ВНК 21/13,в период максимального развития цитопатических изменений проводят сбор вирусной массы, замораживание осуществляют однократно при температуре - 20 С в течение 24 ч, оттаивание при температуре 22 С,центрифугирование осуществляют при 5000 об/мин в течение 30 мин,вирус инактивируют формальдегидом в конечной концентрации 0,03 в течение 24 ч при температуре 26 С, концентрирование осуществляют полиэтиленгликолем в конечной концентрации 8 с последующим добавлением защитной среды,включающей 4 пептона, 2 сахарозы и 1 желатина в соотношении 110 соответственно,тщательно перемешивают, разливают в стерильные ампулы и подвергают сублимационной сушке.