Способ видовой идентификации бруцелл на основе мультиплексной полимеразно-цепной реакции (ПЦР)

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике бруцеллеза, и может быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для выявления видовой идентификации культур бруцелл, а также дифференциации вакцинных штаммов В.19, В..1, В.51. Предложен способ выявления и идентификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции,позволяющий детектировать возбудителя бруцеллеза при проведении диагностических исследований и дифференцировать бруцеллы от других возбудителей инфекционных заболеваний, а также от представителей сапрофитной микрофлоры. Внедрение в практику данного способа позволит сократить время видовой идентификации бруцелл до одного рабочего дня и снизить вероятность инфицирования персонала.(72) Абишева Гульзада Думановна Шевцов Александр Борисович Каиржанова Алма Дуйсенбайкызы Муканов Касым Касенович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике бруцеллеза, и может быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для видовой идентификации культур бруцелл, а также дифференциации вакцинных штаммов В.19,В..1, В.51. В настоящее время род бруцелл включает в себя 10 видов, из них 7 инфицируют наземных млекопитающих - В. , В. , В. . В., В. , В. , В.и В. . От морских млекопитающих выделено 2 вида бруцелл В.и В. . При выделении культуры очень важна видовая идентификация бруцелл в связи с их разной степенью патогенности. Например, в эпидемиологическом отношении наиболее опасен бруцеллез овец и коз вызванный,с которым связано возникновение 91-100 новых случаев заболевания людей бруцеллезом. Уровень техники. Классическая видовая идентификация бруцелл основана на фенотипических показателях требует высокой квалификации лабораторных работников и длительного времени. Кроме того большинство лабораторий не обеспечены необходимыми реагентами для идентификации В. , поэтому согласно рекомендациям Международного эпизоотологического бюро (МЭБ) окончательную бактериологическую идентификацию бруцелл необходимо проводить в референтных лабораториях. Также данная процедура остается основным риском инфицирования лабораторных работников. Внедрение в практику методов основанных на полимеразноцепной реакции (ПЦР) позволяет сократить время видовой дифференциации культур бруцелл, до 1-го дня,снизить вероятность инфицирования персонала, а также улучшить качество диагностики. Аналоги изобретения. В зарубежной литературе описаны способы видовой идентификации бруцелл на основе ПЦР. Протокол, предложенный Вс соавторами, позволяет проводить видовую дифференциацию В.биоваров 1, 2 и 4, В., В.и В 1-го биовара В. . ,. М. .. 1,2,4,,,. 1//. . . - 1994. . 32. - . 2660-2666 Последующие усовершенствования протокола позволили проводить дифференциацию вакцинных штаммов В.19 и В.51 . . , В. ., 1951 //.2000 38(8) 3085-3086 Предлагаемый нами способ отличается от выше приведенных аналогов возможностью идентифицировать 8 видов бруцелл и дополнительно дифференцировать вакцинный штамм В.. 1. 2 Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является способ, предложенный- . 779-781., который позволяет дифференцировать 8 видов бруцелл В. , В. , В. , В., В. , В. , В. , В. , а также вакцинные штаммы В.19, В.. 1, В.51. Данный способ основан на использовании 8 пар праймеров подобранных к вариабельным участкам бруцелл. Предлагаемый нами способ отличается от выше приведенного аналога составом реакционной смеси, благодаря которому лабораторному специалисту не требуется смешивать ПЦР продукты с погрузочным буфером перед проведением электрофоретического учета используемыми ферментами, в нашем способе используется смесьиполимеразы в соотношении 201 что снижает себестоимость реакции, не влияя на качество результата температурными режимами ПЦР амплификации. Сущностью изобретения является разработка способа видовой идентификацию бруцелл и дифференциация вакцинных штаммов В.19,В..1, В.51 на основе ПЦ Задачей изобретения являлась разработка способа,позволяющего проводить видовую идентификацию бруцелл и дифференциацию вакцинных штаммов В.19, В..1, В.51 на основе ПЦР, оптимизация состава реакционной смеси,позволяющего проводить электрофоретический анализ без смешивания образцов с погрузочным буфером и оптимизация состава ферментов. Технический результат. Способ видовой идентификации бруцелл и дифференциации вакцинных штаммов В.19, В..1, В.51 на основе ПЦР позволит сократить время видовой идентификации от 5 дней до 1 дня. Результат достигается выделением ДНК и постановой ПЦР с праймерами, предложенными, , , . -.19511. // . . -2006,- . 52. - . 779-781. с ниже приведенным составом реакционной смеси и программой ПЦР амплификации Состав реакционной смеси 75 мМ - ( 8,8 при 25 С), 20 мМ (4)24, 0,01 Твин 20,3 мМ 2, дезокси нуклеотид трифосфаты в концентрации 330 нМ каждого,5 нМ тетраметиламмония хлорида, 100 мМ трегалозы, 60 мМ сахарозы, ксилен цианол 10 мг/мл, бетаин - до финальной концентрации 0,2 М, 2 единицы смесииполимеразы в соотношении 201. Программа ПЦР амплификации приведена в Программа ПЦР амплификации Процесс Денатурация Денатурация Отжиг Элонгация Элонгация Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером Пример 1 Предлагаемый способ обладает высокой специфичностью и диагностической эффективностью. Оценка специфичности и диагностической эффективности способа была проверена на 8 коллекционных штаммах бруцелл. Учет результатов ПЦР анализа проводили методом электрофореза в 1,5 агарозном геле в присутствии интеркалирующего красителя этидиум бромида. Видовую идентификацию проводили по патерному профилю ПЦР продуктов (фиг.1). Результаты испытания приведены в таблице 1. Таблица 1 Результаты ПЦР анализа Бактериологическая идентификация В.В.19 В.51 В.В.В.В.В. Специфическая полоса на электрофорерограмме п.н. 21 27 45 58 79 10 168 252 8 2 0 7 4 71 2 4 Пример доказывает,что результаты бактериологической и молекулярно генетической идентификации с применением предлагаемого способа совпадают. Способ обладает значительными диагностическими возможностями и хорошими эксплуатационными качествами, в частности, простота использования и интерпретации результатов,мультиплексирование позволяет исследователям в одной пробирки проводить видовую идентификацию всех видов бруцелл, а также штаммовую идентификацию ряда вакцинных штаммов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ видовой идентификации бруцелл на основе мультиплексной полимеразно-цепной Интерпретация ПЦР идентификации В.В.19 В.51 В.В.В.В.В. реакции (ПЦР), включающий вакцинные штаммы,отличающийся тем, что используют вакцинные штаммы 19,51 и 1, при этом состав реакционной смеси ПЦР включает 75 мМ ( 8,8 при 25 С), 20 мМ (4)2 О 4, 0,01 Твин 20,3 мМ 2, дезокси нуклеотид трифосфаты в концентрациях 330 нМ, 5 нМ тетраметиламмония хлорида, 100 мМ трегалозы, 60 мМ сахарозы, ксилен цианол 10 мг/мл, бетаин - до финальной концентрации 0,2 М, 2 единицы смесииполимераз в соотношении 201, программа ПЦР амплификации включает первичную денатурацию при 95 С в течение 5 минут 27 циклов при 95 С в течение 40 секунд, при 60 С - 35 секунд, при 72 С 4 мин.