Способ выявления и идентификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для выявления и родовой идентификации бруцелл в клиническом материале, а также в бактериальных культурах,повышая эффективность и специфичность лабораторной диагностики бруцеллеза. Предложен способ выявления и идентификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции,позволяющий детектировать возбудителя бруцеллеза при проведении диагностических исследований и дифференцировать бруцеллы от других возбудителей инфекционных заболеваний а также от представителей сапрофитной микрофлоры Внедрение в практику данного способа позволит сократить время постановки диагноза до одного рабочего дня и снизить вероятность инфицирования персонала.(72) Шевцов Александр Борисович Абишева Гульзада Думановна Шевцова Елена Сергеевна Муканов Кысым Касенович Каиржанова Алма Дуйсенбайкызы Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) 30759 Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике бруцеллеза, и может быть использовано для решения актуальных задач ветеринарной диагностики, в частности, для выявления и родовой идентификации бруцелл в клиническом материале, а также бактериальных культур. Несмотря на значительный прогресс в контроле и борьбе с инфекционными заболеваниями,бруцеллез остается одной из самых важных зоонозных инфекций, с огромным территориальным ареалом персистирования в животных. Высокий уровень инфицирования домашних животных пропорционально коррелирует с заболеваемостью человека. Ежегодно в мире регистрируется более 500 тысяч новых случаев бруцеллеза людей. . - 2006. - . 6. - . 91-99. По заболеваемости людей Казахстан входит в 25 стран с максимальным уровнем инфицирования,,, ,. .,О..,. .,О. .//. - 2013. - . 3 .- . 177-184 Успех борьбы с бруцеллезом напрямую зависит от эффективности диагностических мероприятий,которые в первую очередь должны быть направлены на раннее выявление инфекции. Уровень техники. Для диагностики бруцеллеза животных используют серологические,бактериологические и молекулярно генетические методы. Серологические методы, такие как реакция связывания комплемента(РСК) и иммуноферментный анализ (ИФА), используют для массового скрининга животных, с целью выявления иммуноположительных животных. При выделении иммуноположительных животных требуется подтверждение диагноза бактериологическим методом. Бактериологический метод диагностики с постановкой биологической пробы занимает длительное время от 2 недель до 3 месяцев, что неблагоприятно влияет на проведение оздоровительных мероприятий и последующую ликвидацию болезни. Кроме того чувствительность бактериологического метода варьирует в пределах 30-90.//. - 1999. - . 37. - . 34373442 , , , . , ., , ., . ... - 2007. - . 59. - . 23-32., и требует соблюдение строгих правил бактериологической безопасности с целью предотвращения заражения лабораторных работников. Тем не менее, бруцеллез остается основной инфекцией внутрилабораторного инфицирования персонала,2,,,-//. - 2013. - . 51. - . 3055-3062 Внедрение в практику методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет сократить время постановки диагноза до одного рабочего дня и снизить вероятность инфицирования персонала. По своей чувствительности и специфичности ПЦР приравнивается к золотому стандарту. Аналоги изобретения. В результате проведенного патентного поиска на веб-ресурсах//,содержащих реестр казахстанских, евразийских и российских патентов,заявки описывающие способы выявление и идентификацию бруцелл на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) найдены не были. Тем не менее, похожие работы описываются в зарубежной литературе. Например, ПЦР в режиме реального времени,основанный на специфической амплификации 711, предложенныйс соавторами,,,, , -., . , .// . . . -2004. -. 42. . 1290-1293., позволяет выявлять не мене 150 фг(фемтограмм). Способ выявления и идентификации бруцелл на основе ПЦР амплификациигена был описанТ. с соавторамиТ.,М.,,.,-2004. - . 42. - . 2261-2263., предел чувствительности данного протокола составляет 2000 (400 КОЕ) фг для В. , В. , В.и 200 (40 КОЕ) фг для В.и В. . .с соавторами , ,, .//.1992 г - . 95.- . 271-275. разработали способ основанный на специфической амплификации 31. Авторы показали, что специфические праймеры,подобранные к нуклеотидной последовательности генов , 711 и 31, могут быть использованы для родовой идентификации бруцелл и их выявления в клиническом материале. Описанные способы избраны нами в качестве прототипа. Отличительными признаками данного способа от прототипов является использование в качестве мишени для ПЦР амплификации нуклеотидной последовательности ор 2 гена, а также структура нуклеотидной последовательность олигонуклеотидов (праймеров). Сущностью изобретения является разработка способа выявления и идентификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции для диагностики бруцеллеза и родовой идентификации бактериальных культур. Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего детектировать возбудителя бруцеллеза при проведении диагностических 30759 исследований и проводить дифференциацию бруцелл от других возбудителей инфекционных заболеваний а также от представителей сапрофитной микрофлоры. Технический результат. Предложен способ выявления и родовой идентификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции,позволяющий сократить время постановки диагноза. Результат достигается выявлением возбудителя бруцеллеза методом полимеразной реакции с праймерами, подобранными к нуклеотидной последовательности ор 2 гена. Праймеры на этот ген имеют следующие последовательности 2 5- -3 2 5 -3 Результаты оценивают методом электрофореза в агарозном геле в присутствии интеркалирующего красителя этидиум бромида по наличию в дорожках специфического ПЦР продукта молекулярной массой 246 пар нуклеотидов. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Сущность изобретения поясняется высокой специфичностью и низким пределом чувствительности разработанного спососба Пример 1 Специфичность ПЦР протокола была проверена на 78 коллекционных образцах ДНК (фиг.1). ПЦР была выполнена в общем объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили праймеры по 10 пмоль каждого ДНК бруцелл в концентрации 2-4 нг и ДНК остальных видов бактерий в концентрации не менее 20 нг в реакции, (таблица 1) 1 Ед.0,2 каждого дНТФ 1-х ПЦР буфер (, 10- ( 8,8 при 25 С), 50 КС 1, 0,08 (объем/объем)Р 40) ионы магния от 2,0 М воды до 25 мкл. 1-22 В. , 23 - 42 В. , 43-53 В. ,54-55 В. , 56 - В. , 57-58 . ,59-61 .62 С.63 С.64-66 .67-69., 70-75- . 76-77. 78 . ,маркер молекулярного веса(100 - 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.) Фиг.1 Электрофорерограмма оценки специфичности разработанного протокола выявления бруцелл. Из результатов, приведенных на фиг.1 видно, что разработанный ПЦР протокол позволяет амплифицировать фрагмент целевого гена ор 2 только в образцах содержащих ДНК бруцелл. Отсутствие неспецифических ПЦР продуктов в образцах ДНК посторонней микрофлоры доказывает специфичность отжига праймеров на целевые фрагменты ДНК, даже при содержании посторонней ДНК матрицы в концентрации от 2 до 8106 геномных эквивалента (расчет количества копий ДНК проводили с использованием интернет ресурса////.). Полученные результаты указывают на высокую специфичность разработанного протокола. Пример 2 Чувствительность разработанного протокола была проверена на двукратном разведении ДНК 5 видов бруцелл (таблица 1) в концентрациях от 5 нг Концентрация ДНК при оценке чувствительности Номер п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 Концентрация ДНК нг 5 2,5 1,25 0,625 0,3125 0,15625 0,078125 0,0390625 Концентрация ДНК нг 0,01953125 0,009765625 0,004882813 0,002441406 0,001220703 0,000610352 0,000305176 0,000152588 Концентрация ДНК нг 7,62939 Е-05 3,8147 Е-05 1,90735 Е-05 9,53674 Е-06 4,76837 Е-06 2,38419 Е-06 1,19209 Е-06 Отрицательный контроль На фиг.2 представлены результаты оценки чувствительности протокола с использованием ДНК В . 30759 1-24 образцы согласно таблице 1, М - маркер молекулярного веса(100 - 10000 п.н., от 100-1000 шаг 100 п.н.) Фиг.3 Электрофореграмма оценки чувствительности разработанного протокола Как видно на фиг.2 имеется прямая корреляция от концентрации ДНК и уровня интенсивности окраски ПЦР продуктов. Наименьшая концентрация ДНК, при которой отчетливо регистрируется ПЦР продукт 76 фг. Таким образом, чувствительность ПЦР протокола составляет не мене 76 фг или около 21 геномной копии ДНК. Расчет копийности ДНК проводили согласно данным, ,,.,. ., ,//. - 2013. -. 25.- . 7281 Чувствительность способа в 76 фг достаточна для его использования при диагностике бруцеллеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления и индетификации бруцелл на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР),предусматривающий выделение ДНК, поставному ПЦР, отличающийся тем, что в качестве затравок ПЦР используют праймеры, подобранные к нуклеотидной последовательности 2 гена,имеющие следующие последовательности 2 5- -3 2 5 - -3.