Способ получения антигена из бруцелл для иммуноферментного анализа

(51) 61 39/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Предлагаемый способ включает выращивание бруцелл на питательной среде, инактивированной при 80 С в течение 1 часа, приготовлении бактериальной взвеси, отличающийся тем, что антиген из бруцелл готовят путем воздействия на микробную суспензию ультразвука с частотой 22 кГц и мощностью до 100 вт/см 2 с последующим осаждением не разрушенных клеток,центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин.,а надосадочную часть повторно центрифугируют, при 18-20 тыс.об/мин., осадок доводят физиологическим раствором до прежнего объема и используют в ИФА в рабочем титре.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ БРУЦЕЛЛ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к области микробиологии, в частности, к способу получения антигена из бруцелл для ИФА. Изобретение относится к области микробиологии, в частности, к способу получения антигена из бруцелл для иммуноферментного анализа(ИФА). Известен способ получения бруцеллезного антигена для сенсибилизации полистироловых планшетов, заключающийся в приготовлении бактериальной массы определенной концентрации, инактивации бруцелл при 80 С в течение 1 часа с последующей проверкой на стерильность, активность (Сайдулдин Т.С. Основы серологии. Алма-Ата, Гылым, 1992, с.272). Недостатком этого способа является его низкая активность и недостаточная специфичность. Указанный недостаток связан, прежде всего, с отсутствием данных о месте локализации активных начал в бруцеллезной клетке и способе извлечения их из микробной клетки. Задачей изобретения является разработка высокочувствительного и специфичного антигена из бруцелл. Технический результат достигается путем разрушения микробных клеток энергией ультразвуковых волн с последующей дифференциацией активных начал центрифугированием. Для получения бактериальной массы бруцеллы выращивают на плотной или жидкой питательной среде (МППГТА, МППГГБ, эритрит агар и др.) в течение 2-3 суток. Выращенную культуру освобождают от питательной среды путем фильтрации бактериальной взвеси через ватномарлевый фильтр и подвергает дезинтеграции энергией ультразвуковых волн. Полученный дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30-40 минут, надосадочную часть декантируют и повторно центрифугируют при 1820 тыс.об/мин. Осадок доводят физиологическим раствором до прежнего объема и используют в ИФА в рабочем титре. Постановку ИФА осуществляют следующим образом. В сенсибилизированные бруцеллезным антигеном лунки вливают по 0,1 см сыворотки. Затем планшеты ставят в термостат при 37 С. По истечении 30 минут планшеты извлекают и промывают три раза специальным раствором для промывания. Затем в лунки добавляют по 0,1 см 3 коньюгата и ставят планшеты в термостат при 37 С на 20 минут. После чего планшеты вновь промывают три раза и добавляют в лунки по 0,1 см 3 субстрата(тетраметилбензидин). Планшеты оставляют при комнатной температуре в темном месте на 20 минут, а затем добавляют по 0,05 см стоп-реагента (0,5 молярный раствор серной кислоты). Считывание результатов проводят визуально (по изменению цвета) либо на фотометре(по показателям оптической плотности). Активность ИФА при постановке на планшетах,сенсибилизированных различными антигенами,показана в таблице 2. Таблица 2-/-/ Примечание. В дробных обозначениях числитель - показатель ИФА с существующим антигеном, знаменатель - с опытным антигеном. Как видно из данных приведенной таблицы активность полученного нами антигена в сотни раз превышает аналогичные показатели существующего-/ антигена. Специфичность ИФА с указанными антигенами проверена при исследовании сывороток крови овец и крупного рогатого скота. Полученные данные представлены в таблице 3. Таблица 3 Результаты исследований сывороток крови Результаты исследований по ИФА ОпытныйСуществующийпол. сом. отр. пол. сом. отр. 32 31 2 2 9 34 4 39 Из данных таблицы 3 видно, что опытный антиген выявляет больше положительно реагирующих на бруцеллез животных, чем существующий, а также позволяет разрешать сомнительные случаи. Следовательно, активность и специфичность опытного антигена превышают эти показатели существующего. Следовательно, применение разработанного нами способа получения антигена из бруцелл в ИФА позволяет значительно повысить выявляемость больных животных и снизить затраты на получение большого количества антигена в связи с меньшей активностью существующего. Таким образом, разработанный нами способ получения антигена из бруцелл для ИФА, включает выращивание бруцелл на искусственной питательной среде, инактивацию микробных клеток при 80 С в течение 1 часа, приготовление бактериальной взвеси, отличающейся тем, что антиген из бруцелл готовят путем воздействия на микробную суспензию энергией ультразвуковых волн с частотой колебательных движений 22 кГц и мощностью до 100 вт/см 2 с последующим осаждением неразрушенных клеток центрифугированием при 6000 об./мин. в течение 30 минут, а над осадочную часть подвергают повторному центрифугированию при 18-20 тысяч об/мин. в течение 45 минут. Полученный осадок разводят до прежнего объема и в рабочем титре используют для сенсибилизации лунок, с целью последующей постановки ИФА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена из бруцелл для иммуно-ферментного анализа,включающий выращивание бруцелл на искусственной питательной среде, инактивацию при 80 С в течение 1 часа, приготовление бактериальной взвеси,отличающийся тем, что антиген из бруцелл готовят путем воздействия на микробную суспензию ультразвуковых волн с частотой колебательных движений 22 кГц и мощностью до 100 Вт/см 2 с последующим осаждением неразрушенных клеток центрифугированием при 6000 об./мин в течение 30 минут, а надосадочную часть повторно центрифугируют,при 18-20 тыс.об/мин., осадок доводят физиологическим раствором до прежнего объема и используют в ИФА в рабочем титре.