Штамм бактерий Brucella abortus 0006/В, используемый для приготовления диагностических и профилактических препаратов

(51) 61 39/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к ветеринарной микробиологии и иммунологии и может быть использовано для диагностики и профилактики бруцеллеза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в сохранении стабильной-формы штаммапри длительном культивировании,с хорошими ростовыми свойствами бактериального газона. Штамм бактерий 0006/В,депонирован в лаборатории Коллекции микроорганизмов Республиканское государственное предприятие Научно -исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан,используемый для получения диагностических препаратов.(72) Сансызбай Абылай Рысбайулы Еспембетов Болат Аманбаевич Зинина Надежда Николаевна Сырым Назым Сырымкызы Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Сармыкова Махпал Кенжеевна Нисанова Райхан Куановна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 5198, кл. А 61 К 39/10, 1997(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 0006/В, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики и профилактики бруцеллеза животных. Известен диагностический препарат,включающий выращивание штамма 19 на питательной среде с последующим смывом,отмывание и суспензирование бруцелл,инактивацию полученной суспензии нагреванием и добавление буферного разбавителя Предварительный патент РК 5198,кл. А 61 К 39/10, 1997. Недостатком штамма 19 при изготовлении диагностических препаратов является недостаточное накопление бактериальной массы на питательной среде (эритрит-агаре). Задачей изобретения является получение слабовирулентного штаммадля приготовления диагностических препаратов. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в сохранении стабильной-формы штаммапри длительном культивировании,с хорошими ростовыми свойствами бактериального газона. Штамм бактерий 0006/В,депонирован в лаборатории Коллекции микроорганизмов Республиканское государственное предприятие Научно исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, используемый для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Штамм получен путем ступенчатого отбора колоний в -форме по Уайт-Вильсону. Штамм характеризуется следующими признаками, которыми обладает культура. Морфологические признаки. Бактерии штамма грамотрицательные, овоиды, красные от 0,4-2,50,40,6 мкм, неподвижные, специализированные клетки не образуют. Культуральные свойства. На эритрит агаре с добавками вырастают янтарные, прозрачные,выпуклые колонии, круглые с гладкими краями. Накопление бакмассы наблюдается через 24-48 часов выращивания. В питательном бульоне образуют равномерную муть с пристеночным кольцом. Аэроб. Оптимальная температура выращивания 37 С при рН 6,8-7,2. Биохимические свойства. Обладает уреазной,оксидазной и каталазной активностью. Антигенная структура. Содержит типичный набор антигенных детерминант, характерных дляв -форме. Патогенные свойства. При определении вирулентности по методу Коротича-Галота установлено, что штамм 0006/ В имеет слабую вирулентность. Пример 1. Для выделения культуры используют биофабричную среду Питательная среда для выделения и культивирования бруцелл сухая дрожжевого экстракта и -цистина. Данную среду растворяют в дистиллированной воде, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин до полного растворения агара, затем вливают глицерин и через 1 мин засыпают глюкозу, дрожжевой экстракт и -цйстин,доводят до кипения и фильтруют через ватномарлевый фильтр, разливают в бактериологические пробирки по 5-6 см и автоклавируют в течение 20 мин при температуре 121 С. После автоклавирования пробирок скашивают до застывания агара. Для контроля стерильности их помещают на 48 часов в термостат при температуре 37 С. Мясо-пептонный бульон. Для приготовления мясо-пептонного бульона на 1 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г химически чистой поваренной соли. Смесь подщелачивают до рН 7,4, кипятят в течение 20 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в бактериологические пробирки по 5-6 см 3 и стерилизуют при при 121 С в течение 20 мин, рН среды после стерилизации должен быть 7,2. Транспортная среда(Метод Кастанеда). Сущность метода заключается в том, что применяется среда, состоящая из двух фаз - твердой и жидкой находящаяся в одном флаконе. Готовится среда следующим образом в 100-граммовые круглые флаконы разливается по 50 см 3 агара. После стерилизации флаконы укладывают так, чтобы агар застыл в форме косяка. В каждый флакон стерильно добавляют по 10 см 3 стерильного глюкозоглицеринового бульона с 2 лимоннокислого натрия (для предупреждения свертывания крови). Подготовленные питательные среды выдерживают в термостате при 37 С в течение 1-2 суток. Материал из флакона с транспортной средой или кровь одного больного, взятую в пробирки с(К 2) (10.8 ), засевают по Кастанеда в 2 флакона из расчета 2-5 см 3 в каждый. Посевы инкубируют при 37 С присутствие содержания 10 СО 2 в первой генерации. Один из флаконов помещают в эксикатор с повышенным содержанием углекислоты, а другой содержат в обычных условиях. Начиная с 4 дня после посева, флаконы просматривают и при отсутствии роста поверхность агара легким покачиванием флакона орашают бульоном. При положительном результате на поверхности агара появляются колонии бруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то в этом случае делают контрольный высев из бульона на твердую питательную среду. Пример 2. Для бактериологического исследования брали цельную кровь от крупного рогатого скота с/о Каратурык, Енбекшиказахского района, Алматинской области в пробирки с(К 2) (10.8 ). Кровь высевали сразу после взятия в питательные среды (МПБ, МПА и транспортная). Инкубирование посевного материала в пробирках проводили при температуре 37 С. При этом первые колонии стали появляться через 20 - 30 суток. Выросшие колоний культур пересевали в пробирки на косяк с эритрит агаром и вегетировали в термостате в течение 48 ч. Пример 3. Для определения таксономических видов и изучения биологических свойств культур была взята дифференциальная таблица тестов,предложенная Федерацией аграрных объединений Всемирной организации здравоохранения(ФАО/ВОЗ). При этом по результатам изучения культурально - морфологических свойств бактерий,микроскопии мазков, окрашенных по Граму и реакции агглютинации со специфической сывороткой, проведенным на первом этапе бактериологических исследований было установлено, что тестируемый изолят бактерий относятся к бруцеллам. Наличие признаков диссоциации в исследуемых культурах определяли пробой с трипофлавином на предметном стекле,реакцией термоагглютинации, окраской колоний по Уайт-Вилсону. С целью дифференциации,исследуемых культур бруцелл изучали их редуцирующую активность в отношении красок основного фуксина и тионина, интенсивность образования сероводорода, агглютинабельность с помощью пробирочной реакции агглютинации с моноспецифическими сыворотками -ии чувствительность культур бруцелл к бруцеллезному бактериофагу. Также был изучен характер роста, дифференцируемых культур бруцелл на питательных средах с добавлением пенициллина и стрептомицина Результаты типирования изолятов бруцелл, выполненные в рамках рекомендуемой ФАО/ВОЗ схемы позволили определить, что эпизоотический изолят выделенный от крупного рогатого скота с/о Каратурык,Енбекшиказахского района, Алматинской области принадлежат к бруцеллам вида В.3 биовара Пример 4. Проведено изучение морфологических свойств выделенных культур бруцелл,из патологического материала электронномикроскопическим методом. В опытах использовали биоматериал,содержащий бактерии рода , который концентрировали путем осаждения на низкоскоростной центрифуге при 3000 об/мин в течение 20 минут. Препарат готовили адсорбцией бактерии в электростатическом поле тефлоновой пластины на сетки с формваровой подложкой, укрепленной углем, контрастировали 2 -ным водным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты с рН 6,8-7,0. Готовые препараты исследовали в электронном микроскопе 100 СХ,при ускоряющем напряжении 80 к и увеличении 10-20 тысяч. Морфометрический анализ размеров бактерий проводили на полученных негативных фотопластинах с помощью увеличительной лупы, со шкалой деления 0,1 мм. Для анализа использовали замеры не менее 100 бактерий. При исследовании негативно окрашенных препаратов бруцелл выявлены как одиночные бактерии, так и их скопления. В популяциях вариантов бруцелл наблюдались шаровидные(кокковидные), овоидные и палочковидные формы бактериальных клеток (рисунок). Очень редко в препаратах наблюдались бактерии неправильной формы. В препаратах отсутствовали бактерии содержащие споры и пили. Из фигуры следует, что морфометрия клетокнепосредственно на фотонегативах с помощью лупы с измерительной шкалой выявила существенные колебания размеров поперечника и длины бактерий. Размер поперечника шаровидных форм составлял в поперечнике 0,3-0,6 мкм и 0,4-0,7 мкм, длине 3,0-1,5 мкм и 0,3-2,5 мкм соответственно, что присуще бактериям. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 0006/В,депонирован в лаборатории Коллекция микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научно исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан, используемый для приготовления диагностических и профилактических препаратов.