Способ изготовления антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза

(51) 61 39/10 (2011.01) 01 33/531 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ 19,-1,61 на питательной среде, приготовления бактериальной взвеси инактивацию и последующее отмывание от мукоидных примесей 1 раствором Твин - 20. Центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе,смешивание, протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином,центрифугирование окрашенной суспензий при 5000 об/мин в течение 30 мин, удаление надосадочной жидкости,взвешивание осадка и ресуспендирование до прежднего объма в фосфатном буфере с 6,0,шуттеллирование в течение 2 ч, введение в конечный продукт насыщенный раствор хлористого кальция (СаС 2) до концентрации 2 и разлив во флаконы. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получений специфического бруцеллезного антигена,обладающего высокой диагностической активностью.(72) Иванов Николай Петрович Саримбекова Сауле Нургалиевна Бакиева Флюра Альбертовна(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ РЕАКЦИИ С МОЛОКОМ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА(57) Изобретение относится к области биотехнологий и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Способ получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза животных, включающий выращивание культур бруцелл вакцинных штаммов, например Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллза животных. Известен способ получения бруцеллзного антигена для постановки кольцевой реакции с молоком, включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде, смыв ее,фильтрование, инактивацию, центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе,протравление и окрашивание бруцелл гемотоксилином, отмывание от остатков краски, прогревание и фасовку, при этом в качестве бруцелл используется слабовирулентный штамм 19(Борисович Ю.Ф., Кирилов Л Ветеринарные препараты справочник // Под ред. Осидзе Д.Ф. М. Колос, 1981.с.183-185). Недостатком этого способа является то, что при этом способе выход антигена не превышает 75, а каждая 1/4 производимая серия препарата может быть забракована из-за образования бактериальными клетками мукоидных(слизеподобных) веществ,обволакивающих микробные тела. При этом снижается чувствительность и специфичность препарата. Кроме того, одноштаммный антиген из одного вида бруцелл не обладает достаточной чувствительностью при исследовании материала от животных кольцевой сывороточной пробой в случае миграции в их организм других не типовых видов бруцелл и не улавливает антитела к фаговым частицам,которые появляются при паразитировании лизогенных культур. Задача изобретения - разработка более эффективного способа получения бруцеллзного антигена для кольцевой реакций с молоком при диагностике бруцеллеза животных, с высоким выходом активнодействующей бактериальной массы. Задача решается тем, что после инактивации бруцелл осуществляют последующее отмывание взвеси бруцелл от мукоидных примесей 1 раствором Твин-20, в конечный продукт добавляют насыщенный раствор хлористого кальция (СаС 2) до концентрации 2. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении высокого выхода специфичного бруцеллзного антигена,обладающего высокой диагностической активностью. Способ получения бруцеллзного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллза животных, включающий выращивание культур бруцелл вакцинных штаммов, например 19,-1,61 на питательной среде, приготовление бактериальных взвесей инактивацию их и последующее отмывание от мукоидных примесей 1 раствором Твин-20 в течение 2-3 часов в кипящей водяной бане, центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе,смешивание,2 протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином, центрифугирование окрашенной суспензии при 5000 об/мин в течение 30 мин. удаление надосадочной жидкости, взвешивание осадка и ресуспендирование до 4 концентрации в фосфатном буфере с 6,0, шуттелирование в течение 2 ч. Внесение в конечный продукт насыщенного раствора хлористого кальция (СаС 2) до концентрации 2 и разлив во флаконы. Антиген для кольцевой реакции с молоком применяют с целью проверки благополучия по бруцеллезу молочных стад, контроля молока на рынках и постановки кольцевой сывороточной пробы. Штаммы, используемые для изготовления антигена, должны иметь типичные для них свойства,описанные в соответствующих паспортах. Способ получения бруцеллзного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллза животных. Пример 1. Техника изготовления бруцеллзного антигена. Бруцеллы штаммов, например 19,-1,61 высевают на питательную среду, с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта,помещенную в посевную мкость. Посев культуры производят общепринятым методом, для чего используют 2- суточную агаровую культуру бруцелл. Накопление бактериальной массы осуществляют при температуре 37 С в течение 48 часов. После окончания выращивания культуры каждого штамма отделяют от питательной среды и разводят стерильным 0,5-м фенолизированным физиологическим раствором до концентрации 100 млрд.м.к. в 1,0 см 3. Смесь инактивируют с последующим отмыванием от мукоидных веществ 1 раствором Твин-20 после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин и сливают надосадочную жидкость. Осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 400 млрд м.к./см 3. Приготовленную суспензию проверяют на чистоту и стерильность путм микроскопии мазков,окрашкнных по Грамму и высева на МПБ, МПА,печеночно- мартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. При отсутствии роста посторонней микрофлоры приготовленная бактериальная взвесь считается пригодной для окрашивания. Хранится антиген в течение 2-3 недель при температуре 2-8 С. 2. Протравливание. В качестве протравы применяют 0,5-ный раствор сернокислого железа окисного(е 2(4)3. Необходимое количество сернокислого железа растворяют в горячей дистиллированной воде и доводят до кипения. Охлажденный раствор фильтруют через бумажный фильтр для удаления красновато- тмно- коричневого преципитата и используют в качестве протравы. При хранении в закрытой мкости раствор может быть пригодным для применения в течение одного года. Для протравливания взвесь бруцелл в дистиллированной воде (400 млрд.м.к.) смешивают с протравой в соотношении 11 и прогревают в водяной бане при температуре 45-50 С в течение 2025 минут. 3. Окрашивание. Для приготовления красящего раствора к 100,0 см 3 приготовленного в стеклянной посуде насыщенного раствора алюмоаммонийных квасцов добавляют раствор гематоксилина (2 гр. краски растворяют в 20,0 см 3 этилового спирта). Полученную смесь облучают ультрафиолетовым светом в открытом стеклянном или фарфоровом сосуде при комнатной температуре в течение трех суток. Раствор краски фильтруют через фильтровальную бумагу 1, добавляют 25,0 см 3 метилового спирта и столько же глицерина. Полученную смесь оставляют при комнатной температуре в открытой бутыли на 3-4 недели для созревания, затем фильтруют и хранят в закрытой емкости. Краска должна иметь красноватомалиновый цвет и может быть пригодна для применения в течение пяти лет. Перед употреблением раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Протравленную бактерийную суспензию окрашивают красящим раствором гематоксилина в насыщенном растворе алюмоаммонийных квасцов,взятых в оптимальной дозе, которую устанавливают титрацией. Для этого, в шесть центрифужных пробирок наливают по 1,0 см 3 испытуемой протравленной взвеси бруцелл и микропипеткой добавляют красящий раствор в возрастающих дозах в первую пробирку 0,01, во вторую-0,015, в третью 0,02 и т.д. Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню при температуре 40-45 С на 10 минут и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. По цвету жидкости над осадком определяют оптимальное количество красящего раствора. Жидкость над осадком не должна быть окрашенной,допускается незначительный синеватый оттенок. Для окрашивания всей серии берут такую дозу краски, с которой надосадочная жидкость после центрифугирования остается прозрачной или сохраняет ее следы. Бактерийную взвесь окрашивают гематоксилином, взятым в оттитрованной дозе,прогревают в водяной бане при 70 С 10-15 минут. Окрашенную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в фенолизированным физиологическим растворе до прежней концентрации с внесением в него насыщенного раствора хлористого кальция (СаС 2) до 2 концентрации. Приготовленный антиген разливают во флаконы объмом 10-20 см 3 из нейтрального стекла, закупоривают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. 3. Контроль антигена. Приготовленный антиген проверяют на стерильность, специфичность и активность. Стерильность препарата определяют высевом содержимого 2-3 флаконов каждой серии на питательные среды, элективные для аэробной и анаэробной микрофлоры и грибов. На специфичность и активность каждую серию препарата проверяют контрольной серией антигена на десяти пробах свежего молока от здоровых коров. Молоко каждой пробы наливают по 2,0 см 3 в пробирки. Пробирки встряхивают и в них вливают позитивную бруцеллезную сыворотку в следующих дозах в первую пробирку 0,15 см 3 во вторую 0,1 см 3 и в третью- 0,05 см 3. Пробирки встряхивают,в каждую добавляют по 0,15 см 3 антигена, снова тщательно встряхивают и ставят в термостат или водяную баню при 37-38 С на 2 ч. После этого учитывают результат реакции. Контролем служит четвертая пробирка. Все пробы молока, в которые не добавляли позитивную сыворотку( четвертый ряд пробирок), должны дать чткий отрицательный результат. Во всех трх пробирках или в первых двух с дозой сыворотки 0,15 и 0,1 см 3 в слое сливок должно появиться отчетливое синее кольцо. Активность антигена не должна быть ниже активности контрольной серии антигена,полученной из штамма 19. Срок годности антигена 2 года со дня приготовления при условии хранения при температуре не выше 15 С. Антиген, подвергшийся замораживанию, для применения непригоден Диагностическую ценность антигена,полученного описанным способом, изучали в сравнении с биофабричными антигенами для постановки кольцевой реакции с молоком при исследовании молока. Результаты этих исследований отражены в таблице 1. Как видно из таблицы 1, при исследовании на бруцеллез 135 коров из неблагополучной по бруцеллезу фермы по общепринятым серологическим тестам получены следующие результаты в РА позитивные показания были в 11,11, РСК - 11,85, КР - 13,3, тогда как с предлагаемым антигеном для КР (кольцевой реакций) - 16,29 случаях. Диагностическая эффективность при использовании известного антигена для КР составило 13,3 . В то же время этот показатель при использовании предлагаемого единого цветного антигена для постановки КР с молоком - 16,29. Эффективность применения РА при исследовании сывороток крови животных была равна 11,11, а РСК 11.85. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности и эффективности разработанного антигена, что позволяет использовать его как для постановки кольцевой реакции с молоком на бруцеллез. Таблица Сравнительная оценка эффективности серологических реакций при исследований животных на бруцеллез Вид животного Позитивные показания серологических реакций. Исследования с молоком Исследования с сывороткой крови РА РСК КР с известным антигеном Крупный рогатый Благополучное по бруцеллзу хозяйство Неблагополучное по Бруцеллзу хозяйство Диагностическая эффективность серологических реакций ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления антигена для кольцевой реакций с молоком при диагностике бруцеллза животных, включающий выращивание культуры бруцелл на питательной среде, приготовление взвеси на фенолизированном физиологическом растворе, протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином, отмывание от остатков краски прогревание и фасовку, отличающийся тем, что антиген готовят из трех штаммов бруцелл разной видовой принадлежности, после инактивации бруцелл и последующее отмывание м.к. от мукоидных примесей раствором Твин-20 и добавляют фаг из расчета 10 корпускул на 1 м.к., а в конечный продукт вносят насыщенный раствор хлористого кальция (2) до концентрации 2.