Способ получения антигена для постановки кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/535 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ бруцеллеза животных, включающий выращивание культур бруцелл вакцинных штаммов 19 и 82 на твердой питательной среде, их смыв, фильтрование, инактивацию, центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе,смешивание, протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином,центрифугирование окрашенной суспензии при 5000 об/мин в течение 30 мин, удаление надосадочной жидкости,взвешивание осадка и ресуспендирование до 7 концентрации в молочнокислом буфере с рН 3,6,шуттеллирование в течение 2 ч и разлив во флаконы. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении специифического бруцеллезного антигена, обладающего высокой диагностической активностью.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ПОСТАНОВКИ КОЛЬЦЕВОЙ РЕАКЦИИ С МОЛОКОМ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА(57) Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Способ получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике 21550 Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при изготовлении препаратов для серологической диагностики бруцеллеза животных. Известен способ получения бруцеллезного антигена для постановки кольцевой реакции с молоком, включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде, смыв е,фильтрование, инактивацию, центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе, протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином, отмывание от остатков краски, прогревание и фасовку, при этом в качестве бруцелл используется слабовирулентный штамм 19(Борисович Ю.Ф., Кириллов Л.В. Ветеринарные препараты справочник // Под ред. Осидзе Д.Ф. М. Колос, 1981, с. 183-185). Недостатком известного способа получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком является недостаточная чувствительность и низкая специфичность (выявляет только -формы бруцелл). Задача изобретения - разработка эффективного способа получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении специфического бруцеллезного антигена,обладающего высокой диагностической активностью (выявляет только , , -формы бруцелл). Способ получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза животных, включающий выращивание культур бруцелл вакцинных штаммов 19 и 82 на твердой питательной среде, их смыв, фильтрование,инактивацию,центрифугирование и ресуспендирование в фенолизированном физиологическом растворе, смешивание 111,протравливание и окрашивание бруцелл гематоксилином, центрифугирование окрашенной суспензии при 5000 об/мин в течение 30 мин,удаление надосадочной жидкости, взвешивание осадка и ресуспендирование до 7 концентрации в молочнокислом буфере с рН 3,6, шуттеллирование в течение 2 ч и разлив во флаконы. Антиген для кольцевой реакции с молоком применяют с целью проверки благополучия по бруцеллезу молочных стад и контроля молока на рынках. Штаммы, используемые для изготовления антигена, должны иметь типичные для него свойства, описанные при изготовлении вакцин. Способ получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза животных. Пример 1. Техника изготовления бруцеллезного антигена. Бруцеллы штаммов 19 и 82 высевают на твердую питательную среду 2(эритрит-агар), с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта, помещенную в посевную четверть (колбу Тартаковского). Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные четверти помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуры смывают стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2 из расчета 35-50 мл на одну колбу. Смытые культуры освобождают от остатков питательной среды фильтрованием через четырехслойную марлю,сливают в бутыли и доводят концентрацию 0,5 ным раствором фенола до 100 млрд. м.к./см 3 для штаммов 19 и 82. Смесь инактивируют путем нагревания в водяной бане при температуре 70 С в течение 2 ч,после чего центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин и сливают надосадочную жидкость. Осадок ресуспендируют в фенолизированном физиологическом растворе до концентрации 100 млрд м.к./см 3 и смешивают культуры штаммов 19 и 82 в соотношении 11. Приготовленную суспензию проверяют на чистоту и стерильность путем микроскопии мазков,окрашенных по Грамму и Козловскому, и высева на МПБ, МПА, печеночно-мартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро - по две пробирки и два флакона с 50 мл бульона на каждый образец. За высевами наблюдают в течение 10 дней. При отсутствии посторонней микрофлоры приготовленный антиген считается пригодным для окрашивания. Хранится антиген в течение 2-3 недель при температуре 2-8 С. 2. Приготовление протравы. В качестве протравы применяют 0,5-ный раствор сернокислого железа окисного. Необходимое количество сернокислого железа растворяют в горячей дистиллированной воде и доводят до кипения. Охлажденный раствор фильтруют через бумажный фильтр для удаления красновато-темно-коричневого преципитата и используют для протравы. При хранении в закрытой емкости раствор может быть для применения в течение одного года. 3. Приготовление красящего раствора. К 500 мл приготовленного в стеклянной посуде насыщенного раствора алюмоаммонийных квасцов добавляют гематоксилин,предварительно растворнный в этиловом спирте ректификованном. Полученную смесь облучают фиолетовым светом в открытом стеклянном или фарфоровом сосуде при комнатной температуре в течение трех суток. Раствор краски фильтруют через фильтровальную бумагу 1, добавляют дозы метилового спирта и глицерина. Полученную смесь оставляют при комнатной температуре в открытой бутыли на 3-4 недели для созревания, зачем фильтруют и хранят в закрытой емкости. Краска должна иметь 21550 красновато-малиновый цвет и может быть пригодна для применения в течение пяти лет. Перед употреблением раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Перед окрашиванием бактерийную взвесь протравливают добавляя к каждому литру взвесь раствора сернокислого железа, смешивают и прогревают в водяной бане при температуре 4550 С в течение 20-25 мин. Бактерийную суспензию окрашивают красящим раствором гематоксилина, взятых в оптимальной дозе, которую устанавливают титрацией. Для этого в шесть центрифужных пробирок наливают по 1 мл испытуемой протравленной взвеси бруцелл и микропипеткой добавляют красящий раствор в возрастающих дозах в первую пробирку 0,01, во вторую - 0,015, в третью - 0,02 и т. д. Пробирки встряхивают, ставят в водяную баню при температуре 40-45 С на 10 мин и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. По цвету жидкости над осадком определяют оптимальное количество красящего раствора. Жидкость под осадком не должна быть окрашенной, допускается незначительный,синеватый оттенок. Для окрашивания всей серии берут такую дозу краски, с которой надосадочная жидкость после центрифугирования остается прозрачной или сохраняет ее следы. Бактерийную взвесь окрашивают гематоксилином, взятым в оттитрованной дозе,прогревают в водяной бане при 40 С 10-15 мин. Окрашенную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость удаляют, а осадок взвешивают и по его результатам ресуспендируют до 7 концентрации в молочнокислом буфере с рН 3,6 и шуттеллируют в течение 2 ч. Приготовленный антиген разливают во флаконы объемом 10-20 см 3 из нейтрального стекла,закупоривают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. 3. Контроль антигена. Приготовленный антиген проверяют на стерильность, специфичность и активность. Стерильность препарата определяют высевом содержимого 2-3 флаконов каждой серии на питательные среды, элективные для аэробной и анаэробной микрофлоры и грибов. На специфичность и активность каждую серию препарата проверяют контрольной серией антигена на десяти пробах свежего молока от здоровых коров. Молоко каждой пробы наливают по 2 мл в пробирки и добавляют по 0,2 мл 20-ного раствора хлористого натрия. Пробирки встряхивают и вводят в них позитивную бруцеллезную сыворотку в следующих дозах в первую пробирку 0,15 мл, во вторую - 0,1 мл и в третью -0,05 мл. Пробирки встряхивают, в каждую добавляют по 0,15 мл антигена, снова тщательно встряхивают и ставят в термостат или водяную при 37-38 С на 2 ч. После этого учитывают реакцию. Контролем служит четвертая пробирка. Все пробы молока, в которые не добавляли позитивную сыворотку (четвертый ряд пробирок),должны дать четкий отрицательный результат. Во всех трех пробирках или в первых двух с дозой сыворотки 0,15 и 0,1 мл в слое сливок должно появиться отчетливое синее кольцо. Активность антигена не быть ниже активности контрольной серии антигена, полученной из штамма 19. Срок годности антигена 2 года со дня приготовления при условии хранения при температуре не выше 15 С. Антиген, подвергшийся замораживанию, для применения непригоден. Диагностическую ценность антигена,полученного описанным способом, изучали в сравнении с биофаричными антигенами для постановки кольцевой реакции с молоком при исследовании молока крупного рогатого скота в производственных условиях. Результаты этих исследований отражены в таблице. Как видно из таблицы, при исследовании на бруцеллез 118 коров из условно неблагополучного хозяйства по общепринятым серологическим тестам получены следующие результаты в РА позитивные показания были в 14, РДСК - 15, КР - 23, тогда как с предлагаемым антигеном для КР (кольцевой реакции) - 17 случаях. Диагностическая эффективность при использовании известного антигена для КР составила 14,4 . В то же время этот показатель при использовании предлагаемого антигена для постановки КР с молоком - 19,49. Эффективность применения РА при исследовании сывороток крови животных была равна 11,86, а РДСК - 12,71. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности и эффективности разработанного антигена, что позволяет использовать его как для постановки кольцевой реакции с молоком на бруцеллез. 21550 Таблица Сравнительная оценка эффективности серологических реакций при исследовании животных на бруцеллез Вид животного Благополучное по 96 бруцеллезу хозяйство Неблагополучное 118 по бруцеллезу хозяйство Диагностическая эффективность серологических реакций ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для постановки кольцевой реакции с молоком при диагностике бруцеллеза животных, включающий выращивание культуры бруцелл на твердой питательной среде, их смыв,фильтрование,инактивацию,центрифугирование и рссуснсндирование в физиологическом растворе, протравливание и окрашивание бруцелл гемотоксилином, отмывание от остатков краски, прогревание и фасовку, Позитивные показания серологических реакций исследования с молоком исследования с сывороткой крови КР с КР с РА РДСК известным предлагаемым антигеном антигеном 17 отличающийся тем, что в качестве бруцелл используют культуры бруцелл вакцинных штаммов 19 и 82, смешивание культур с концентрацией 100 млрд м.к./см 3 осуществляют перед окрашиванием в соотношении 11, окрашенную суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, надосадоч-ную жидкость удаляют, а осадок взвешивают и по его результатам рссусисндируют до 7 концентрации в молочном буфере с рН 3,6, шуттелируют в течение 2 ч.