Способ получения роз-бенгал антигена для серологической диагностики бруцеллеза

(51) 61 39/10 (2006.01) 01 33/535 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ инактивацию полученной суспензии при температуре 80 С в течение 60 мин, смешиванием в соотношении 111 с последующей адсорбцией бруцеллезного фага ТБ на инактивированных бруцеллах из расчета 10-100 фаговых корпускул на 1 микробную клетку в течение 22-24 часов при температуре 2-4 С,центрифугированием бактериальной взвеси, приготовлением из осадка 100 млрд. взвеси на 0,5-ном фенолизированном физиологическом растворе,последующее окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой,центрифугирование и ресуспендирование в буферном разбавителе,включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту. Полученный антиген способен вступать в реакцию с антибруцеллезными и антифаговыми антителами,способствует более полному выявлению животных, больных бруцеллезом,особенно больных латентной или хронической формами бруцеллеза, у которых присутствуют антифаговые антитела.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РОЗ-БЕНГАЛ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза. Способ получения роз-бенгал антигена для серологической диагностики бруцеллеза включает выращивание бруцелл штаммов 19,-1 и 61 на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2), 21551 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при приготовлении препаратов для диагностики бруцеллеза. Известен способ получения роз-бенгал антигена для серологической диагностики бруцеллеза,включающий выращивание культуры бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием, последующее центрифугирование бактериальной взвеси,приготовлением из осадка 100 млрд. взвеси на 0,5-ном фенолизированном физиологическом растворе, окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой и ресуспендирование в буферном разбавителе, включающим едкий натр,фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту, при этом в качестве бруцеллезной культуры используют штамм 19. (Ветеринарные препараты. Справочник под ред. Д.Ф. Осидзе. - М., Колос, 1981. -с. 185188). Недостатком этого способа является то, что получаемые антигены обладают невысокой чувствительностью,реагируют,только с гомологичными антителами, и непригодны для выявления хронических и латентных форм инфекции. Задача изобретения повышение чувствительности антигена. Задача решается тем, что оснбвой для приготовления антигена служат вакцинные штаммы 19,-1 и 61 и бруцеллезный фаг ТБ. Технический результат - повышение чувствительности антигена. Способ получения роз - бенгал антигена для серологической диагностики бруцеллеза включает выращивание бруцелл штаммов 19,-1 и 61 на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2),инактивацию полученной суспензии при температуре 80 С в течение 60 мин, смешиванием в соотношении 111 с последующей адсорбцией бруцеллезного фага ТБ на инактивированных бруцеллах из расчета 10-100 фаговых корпускул на 1 микробную клетку в течение 22-24 часов при температуре 2-4 С,центрифугированием бактериальной взвеси, приготовлением из осадка 100 млрд. взвеси на 0,5-ном фенолизированном физиологическом растворе,последующее окрашивание 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой,центрифугирование и ресуспендирование в буферном разбавителе,включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту. Способ осуществляется следующим образом 1. Техника получения антигена Бруцеллы вакцинных штаммов 19,-1 и 61 высевают на твердую питательную среду (эритрит 2 агар), с добавлением 0,02 цистина и 0,02 дрожжевого экстракта, помещенную в посевную емкость. Посев культуры производят путем увлажнения питательной среды посевным материалом, для чего используют 2-суточную агаровую культуру бруцелл. Засеянные емкости помещают в термостат при температуре 37 С на 48 часов. После окончания выращивания культуру смывают стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором с рН 7,0-7,2. Смытую культуру сливают и инактивируют при 80 С в течение 60 минут. Прогретую суспензию проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму и Козловскому и высева на МПБ, МПА, печеночномартеновский агар и бульон с переваром Хоттингера, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки и два флакона с 50 см 3 бульона на каждый образец За высевами наблюдают в течение 10 дней. Инактивированные суспензии трх штаммов смешивают в соотношении 111. Бруцеллезный фаг ТБ адсорбируют на бруцеллах из расчета 10-100 фаговых корпускул на 1 микробную клетку в течение 22-24 часов при 24 С. Взвесь бактерий с адсорбированным фагом центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 30 минут из осадка готовят 100 млрд. взвесь на 0,5 ном карболизированном физиологическом растворе. Суспензию бруцелл окрашивают 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой в течение 24 ч при комнатной температуре, затем суспензию окрашенных бруцелл центрифугируют с целью отделения бакмассы от избытка краски, и ресуспендируют буферным разбавителем(включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту) при перемешивании в течение 1 часа. 2. Определение активности антигена Полученный антиген стандартизируют по активности с национальной агглютинирующей бруцеллезной сывороткой, содержащей в 1 см 3 1000 международных единицантител. Антиген считают активным и разрешают к выпуску, если он дает агглютинацию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 110, содержащей 50 , 2 креста с сывороткой в разведении 120 (35 ) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 135 (28,5 ). Если антиген отвечает указанным требованиям, приготовленную серию стерильно разливают во флаконы емкостью 10-20 см 3. Флаконы с антигеном плотно закрывают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками,а затем просматривают в проходящем свете. 3. Изучение активности роз-бенгал антигена,содержащего специфический фаг. При проведении производственного испытания роз-бенгал антигена, содержащего специфический фаг, для сравнения использовали роз-бенгал 21551 антиген,изготовленный по существующей методике. Исследованию подвергали пробы сыворотки крови животных благополучного и неблагополучного по бруцеллезу хозяйств. Всего подвергнуто исследованию 863 пробы сыворотки крови, полученных от крупного рогатого скота, 81 от свиней, 1058 - от мелкого рогатого скота. Полученные при этом данные приведены в табл. Таблица Результаты испытания активности и специфичности предлагаемого роз-бенгал антигена в сравнении с существующим антигеном Вид животных Крупный рогатый скот Свиньи Мелкий рогатый скот Крупный рогатый скот Свиньи Мелкий рогатый скот Благополучие Количество хозяйства по исследованных проб бруцеллезу сывороток Неблагополучное 435 Неблагополучное 32 Неблагополучное 456 Благополучное 428 Благополучное 49 Благополучное 602 Примечание в дробных числах числитель абсолютное количество знаменатель -процент. Как видно из данных таблицы 1, активность и специфичность роз-бенгал антигена, содержащего детерминанты трех видов бруцелл и специфические фаги, значительно выше, нежели существующего. При этом отмечена большая чувствительность антигена в случаях исследования сыворотки крови овец и свиней, больных хронической и латентной формой бруцеллеза (повышение выявляемости более чем на 20). Таким образом, полученный антиген способен вступать в реакцию с антибруцеллезными и антифаговыми антителами, что приводит к повышению его чувствительности и способен выявлять животных, больных латентной или хронической формами бруцеллеза, у которых присутствуют противофаговые антитела. Способ получения роз-бенгал антигена для серологической диагностики бруцеллеза,включающий выращивание бруцелл на плотной питательной среде, смыв выращенной культуры стерильным 0,5-ным фенолизированным физиологическим раствором,инактивацию полученной суспензии нагреванием, последующее центрифугирование бактериальной взвеси, и приготовление из осадка 100 млрд. взвеси на 0,5 ном фенолизированном физиологическом растворе,с последующим окрашиванием 1-ным водным раствором краски бенгальской розовой и ресуспендировании в буферном разбавителе,отличающийся тем, что в качестве бруцеллезной культуры используют штаммы 19,-1 и 61, после инактивации бактериальные суспензии смешивают в соотношении 111, а на бактериальные клетки адсорбируют бруцеллезные фаги в количестве 10100 частиц на 1 клетку в течение 22-24 часов при температуре 2-4 С.