Способ изготовления тест-системы для диагностики заболеваний животных, инфицированных S- и R- формами бруцелл методом иммуноферментного анализа

(51) 61 39/00 (2009.01) 61 39/10 (2009.01) 01 33/535 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа,сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют смесью ультразвуковых лизатов бруцелл из штаммов В.19, В.-1, В.61, В.424 в забуференном физиологическом растворе с 7,3(ФСБ) в концентрации 10 мкг/см 3. Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в холодильнике 4 С на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшет отмывают четырехкратно забуференным физиологическим раствором,содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Т), и в каждую лунку вносят по 0,1 см 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют, планшет отмывают вышеописанным способом,высушивают,упаковывают в полиэтиленовый пакет и запаивают. Предлагаемый способ позволяет получить тестсистему для диагностики заболеваний животных,инфицированных бруцеллами разных видов методом иммуноферментного анализа.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Чунчубаев Жолымкан Каликанович Рахимбаев Серик Жумадилович(56) Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. М., 1986, с. 46-106(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ТЕСТСИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖИВОТНЫХ,ИНФИЦИРОВАННЫХ - И - ФОРМАМИ БРУЦЕЛЛ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике заболеваний животных,инфицированных бруцеллами разных видов. Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения диагностикумов для проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано при диагностике заболеваний животных,инфицированных бруцеллами разных видов. Известен принятый за аналог способ получения тест-системы для диагностики бруцеллеза овец методом иммуноферментного анализа, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном из штамма- 1, при этом используют корпускулярный антиген, который вносят в лунки полистироловой планшеты, в забуференном физиологическом растворе с 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности,устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем е инкубации при 37 С в течение 15 мин. (Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. Канд. дисс. М., 1986, с 46-106). Недостатком этого метода получения тестсистемы является невозможность его применения для диагностики бруцеллеза других видов животных методом иммуноферментного анализа,недостаточная активность и специфичность, а также то, что данный способ не позволяет выявлять животных инфицированных бруцеллами в -форме. Известен принятый за прототип способ получения тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном из штамма В.19, при этом используют корпускулярный антиген, который вносят в лунки полистироловой планшеты, в забуференном физиологическом растворе с 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности,устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем е инкубации при 37 С в течение 15 мин. (Маматова З.Б. Иммуноферментный метод диагностики бруцеллеза. Канд. дисс. М., 1986, с 46-106). Недостатком этого метода получения тестсистемы также является невозможность его применения для диагностики бруцеллеза других видов животных методом иммуноферментного анализа,недостаточная активность и специфичность, а также то, что данный способ не позволяет выявлять животных инфицированных бруцеллами в -форме. Целью изобретения является создание единой тест-системы для диагностики заболеваний животных, инфицированных - и - формами бруцелл методом иммуноферментного анализа, а также повышение активности и специфичности диагностикума. Для достижения указанной цели в способе изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа,сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют смесью 2 ультразвуковых лизатов бруцелл из штаммов В.19, В.-1, В.61, В.424 в забуференном физиологическом растворе с 7,3(ФСБ) в концентрации 10 мкг/см 3. Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в холодильнике 4 С на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшет отмывают четырехкратно забуференным физиологическим раствором,содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Т), и в каждую 3 лунку вносят по 0,1 см 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют, планшет отмывают вышеописанным способом,высушивают,упаковывают в полиэтиленовый пакет и запаивают. Пример изготовления тест-системы для диагностики бруцеллеза животных методом иммуноферментного анализа. 1. Приготовление матровой расплодки. Для изготовления серии бруцелл в качестве посевного материала используют сухую эталонную культуру вакцинных штаммов В.19, В.1, В.61, В.424. Для получения посевного материала в ампулу с сухой или косяк агара культурой штамма наливают стерильный физиологический раствор до первоначального объема. После полного суспендирования микробной массы готовят 10 кратные разведения в пробирках до 10-710-9, в которые перед разведением разливают стерильный физиологический раствор в количестве 4,5 см. Из двух последних разведений производят высевы по 0,1 см на 3-5 чашек Петри с питательным агаром. Чашки с агаром перед засевом предварительно подсушивают в термостате при 37-38 С в течение 24 часов. Микробную взвесь, засеянную на чашки,равномерно распределяют по поверхности агара и выдерживают в термостате при 37-38 С в течение 46 суток. Посевы просматривают на чистоту и типичность роста колоний. Из чашек отбирают типичные колонии, которые отсевают на пробирки с одной из названных питательных сред. Выращенная в течение 2-3 суток при 37- 38 С культура является исходным посевным материалом, для засева производственных серий бруцеллезной вакцины. Эту рабочую культуру хранят на агаре в пробирках не более 5 недель при температуре 2-4 С. 2. Засев взвеси бруцелл на колбы (четверти,ферментеры). Для засева серии бруцелл двухсуточную культуру вакцинного штамма каждого вида смывают физиологическим раствором или 1 -ой глюкозой и сливают в емкость,наполненную одним из названных растворов из расчета получения 2-5 млрд-ной взвеси микробных клеток в 1,0 см 3 по оптическому стандарту мутности. Для получения такой концентрации на 1,0 дм 3 раствора обычно берут смыв культуры с 4-6 пробирок скошенного агара. Такой расплодкой засевают колбы(четверти) очередной производственной серии. Для посева применяют также 2-3-суточную агаровую культуру, 26152 выращенную на колбах (четвертях). В этом случае засеянные колбы Тартаковского (Ру) или четверти увлажняют посевным материалом из расчета 4,0-5,0 см 3 взвеси и помещают в термостат при 37-38 С на 2-3 суток. Через 24 ч после посева поверхность агара в колбах (четвертях) увлажняют вторично для лучшего роста. Через 2 сут после этого выращенную культуру проверяют на чистоту, типичность роста,затем смывают физиологическим раствором или 1-ой глюкозой и готовят 2-5 млрд-ную взвесь бруцелл для засева питательной среды производственной серии в колбах (четвертях) или ферментерах (из расчета 2-5 млрд бруцелл на 1,0 см 3 жидкой питательной среды). В ферментеры дополнительно добавляют пеногаситель (пропинол-Б- 400) из расчета 0,030,07) к общему объему засеянной среды. 3. Смыв культуры штаммов В.19, В.-1, В.61, В.424 с колб(четвертей), слив с ферментеров. Через 3-4 суток колбы (четверти), где на питательном агаре засеяна культура вакцинного штамма, просматривают на чистоту, типичность роста и отбирают для смыва. Культуру смывают фенолизированным физиологическим раствором (25,0- 30,0 см на одну колбу, или четверть). Смытую с колб (четвертей) культуру отсасывают в одну стеклянную емкость, проверяют на чистоту и типичность морфологических признаков(микроскопированием), определяют оптическую концентрацию, разводят, при необходимости, до нужной величины содержания бруцелл в 1,0 см 3. Для повышения концентрации бруцелл в 1 см 3 перед разливом суспензии допускается отсасывание жидкости,и таким путем увеличивают концентрацию микробных клеток. Бактериальную суспензию,слитую с ферментеров, концентрируют (осаждают) путем добавления 2-ного раствора карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) из расчета 0,2 сухого вещества к объему микробной взвеси. После 72 часового осаждения при температуре 2-4 С надосадочную часть декантируют, а осадок разбавляют фенолизированным физиологическим раствором до нужной концентрации, разливают во флаконы (ампулы), как указано выше и дополнительно проверяют на чистоту путем высева на соответствующие питательные средына концентрацию микробных клеток по бруцеллезному стандарту мутности. 4. Изготовление ультразвукового лизата бруцелл. Отмыв бакмассу штаммов В.19, В.-1, В.61, В.424 от примесей питательной среды осуществляют путем фильтрации через трехслойный марлевый фильтр. Далее добавляют 0,05 М триса или 1/15 М двухзамещенного фосфорнокислого натрия. Полученную микробную суспензию подвергают воздействию ультразвуковых волн частотой 22 КГц и мощностью 70-90 вт/см, генерируемых аппаратом УЗДН-1 или УЗДН-2. После ультразвукового воздействия полученный дезинтеграты сливают в стерильную емкость,доводятдо 6,5-7,0 автоклавируют при 1,0-1,5 атм в течение 20-30 мин. Выпавший белковый осадок удаляют путем центрифугирования при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 мин. а надосадочную жидкость сливают, стерилизуют путем прогревания при 80 С в течение 60 минут. В полученном полуфабрикате определяют количество общего азота и проверяют на стерильность. До получения результатов контроля полуфабрикат хранят при температуре 2-8 С. Полуфабрикат должен быть стерильным и содержать аминного азота 30-50 мг. 5. Смешивание лизатов. Полученные лизаты трех видов бруцелл смешивают в соотношении 111 в стерильных условиях с использованием стерильной посуды. 6 Сенсибилизация планшета антигеном. В лунки планшета вносят по 0,1 см 3 раствора смеси ультразвукового лизата трех штаммов бруцелл в ФСБ в концентрации 10 мкг/см 3. Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в холодильнике 4 С на 18-24 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют, планшет отмывают четырехкратно ФСБ, содержащим 0,05 твина-20(ФСБ-Т), и в каждую лунку вносят по 0,1 см 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы. Через 1 час после инкубации при 37 С содержимое лунок удаляют, планшет отмывают вышеописанным способом,высушивают,упаковывают в полиэтиленовый пакет и запаивают. 6. Проведение ИФА. Комплект перед проведением анализа выдерживают в течение 30 мин при температуре от 20 до 25 С. Затем планшет промывают один раз ФСБ-Т, при этом в каждую лунку планшета вносят от 200 до 250 3 мм раствора. По окончании промывки остатки жидкости удаляют активным встряхиванием,постукивая планшетом по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге. Для внесения контрольных сывороток можно использовать любые лунки планшета. Для этого в лунку 1 вносят 100 мм 3 К, в две лунки (2 и 3) - по 100 мм 3 К-, а в еще одну лунку (4) с РБР-С оставляют для контроля конъюгата. Раствор перемешивают пять раз пипетированием. После этого планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре (371)С. По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т пять раз, как описано выше. После промывки и удаления влаги в каждую лунку планшета вносят по 100 мм 3 раствора конъюгата. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и инкубируют в течение 30 мин при температуре (371) С. По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т пять раз, как описано. В каждую лунку планшета по 100 мм 3 раствора ортофенилендиамин или субстрата 3 тетраметилбензидина. Планшет закрывают крышкой или заклеивают клейкой лентой и помещают на 15 мин в защищенное от света место при температуре(371)С. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку планшета по 50 мм 3 стоп-реагента (0,1 М раствор серной кислоты). Учет результатов реакции. Результаты учитываются в течение 3-х ч. после остановки реакции визуально или спектрофотометрически. Результаты ИФА на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Нулевой уровень (бланк) задают по воздуху. Результаты считаются достоверными только в том случае, если значение ОП в лунке с контролем конъюгата (ОПКг) не превышает 0,15, в лунках с К- среднее значение ОП (ОПК-) не более 0,2, в лунках с К среднее значение ОП (ОПК) не менее 1,0. Визуальный учет для положительной сыворотки антибруцелла КРС при визуальном учете достаточно окрашивание от оранжево-коричневого до коричневого цвета. Пробы с отрицательной сывороткой и конъюгатом не должны изменить окраску или могут иметь слабое пожелтение. Активность препарата проверяли в сравнении с контрольным корпускулярным иммуноферментным диагностикумом. Проведено комплексное исследование на бруцеллез и в двух неблагополучных по бруцеллезу фермах крупного рогатого скота. Всего проведено комплексное (РСК и ИФА) исследование 178 коров разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально реакция связывания комплемента(РА) с коммерческими бруцеллезными антигенами и иммуноферментная тест- система, изготовленная по нашей методике. В результате комплексного исследования выявлено наличие бруцеллеза в ИФА у 18 коров, что подтверждено в РСК и РА в 11 случаев. При этом коммерческим ИФА-диагностикумом результат подтвержден в 14 случаях. Таблица 1 Сравнительная оценка специфичности единой опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота Исследовано животных Метод исследования Ультразвуковая тест-система Далее было проведено комплексное на овцах,диагноз на бруцеллез у которых был предварительно установлен серологическим путм(РА и РСК). В таблице 2 приведены результаты проверки специфичности препарата. Таблица 2 Сравнительная оценка специфичности единой опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике бруцеллеза овец Исследовано животных Метод исследования Ультразвуковая тест-система Как видно из данных таблицы 2,иммуноферментный единый диагностикум из ультразвукового лизата бруцелл проявляет более высокую специфическую активность,чем общепринятый (корпускулярный) диагностикум,применяемый для диагностики бруцеллеза овец. Далее было проведено комплексное исследование на бруцеллез и в неблагополучном по бруцеллезу свиней хозяйстве. Всего проведено комплексное (РСК, РА и ИФА) исследование 30 свиней разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально реакция связывания комплемента(РА) с коммерческими бруцеллезными антигенами и иммуноферментная тест- система, изготовленная по нашей методике. Таблица 3 Сравнительная оценка специфичности единой опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике бруцеллеза свиней Исследовано животных У льтразвуковая тестсистема абс. 12 Метод исследования Корпускулярная РСК тест-система Реагировало положительно абс. Как видно из таблицы 3 в результате комплексного исследования выявлено наличие бруцеллеза в ИФА у 12 свиней, что подтверждено в РСК в 6 случаях, РА в 6 случаях. При этом коммерческим ИФА-диагностикумом результат подтвержден в 10 случае. Далее было проведено комплексное исследование на инфекционный эпидидимит баранов и в неблагополучном по указанной болезни хозяйстве. Всего проведено комплексное (РСК, РА и ИФА) исследование 60 баранов разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально реакция связывания комплемента(РА) с коммерческими бруцеллезными антигенами и иммуноферментная тест- система, изготовленная по нашей методике. В результате комплексного исследования выявлено наличие инфекционного эпидидимита баранов в ИФА у 14 баранов, что подтверждено в РДСК в 11 случаях. При этом коммерческим ИФАдиагностикумом результат подтвержден в 10 случаях. Таблица 4 Сравнительная оценка специфичности единой опытной и контрольной иммуноферментных тест-систем при диагностике инфекционного эпидидимита баранов Метод исследования Корпускулярная тест-система Как видно из данных таблицы 4,иммуноферментный диагностикум из ультразвукового лизата - и - форм бруцелл пригоден для диагностики инфекционного эпидидимита баранов. Следовательно, предлагаемая тест-система из липополисахардного антигена четырех штаммов позволяет выявлять животных, инфицированных и формами бруцелл методом иммуноферментного анализа. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления тест-системы для диагностики заболеваний животных,инфицированных - и - формами бруцелл методом иммуноферментного анализа,включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном из штамма В., с последующей ее инкубацией,отличающийся тем,что сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют смесью ультразвуковых лизатов четырех штаммов бруцелл В. 19, .-1, .61, .424 в забуференном физиологическом растворе с 7,3 (ФСБ) в концентрации 10 мкг/см 3, с последующей инкубацией при 4 С в течение 18-24 часа четырехкратным отмыванием забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,05 твина 20 (ФСБ-Т), внесением в каждую лунку по 0,1 см 3 1 раствора бычьего сывороточного альбумина на ФСБ для блокировки свободных поверхностей твердой фазы, а через 1 час после инкубации при 37 С удаление содержимого лунок, отмыванием планшета вышеописанным способом,высушиванием, упаковкой в полиэтиленовый пакет и запаиванием.