Способ получения анаплазменного антигена

(51) 61 39/02 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(паразитемия 80-90),скармливание животному, в период после заражения и до обескровливания,железосодержащих препаратов (с целью снижения анемии), отмывание эритроцитов физиологическим раствором ( 7,07,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости,разрушение их пятью объмами дистиллированной воды с последующим замораживанием и оттаиванием,выделение анаплазм путм ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 7000 об.,дезинтеграцию центрифугата ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см 2 в течение 812 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 2030 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием при тех же параметрах. Далее,процедуру повторяют до полного истощения осадка(5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Предлагаемый способ способствует более высокому выходу анаплазменного антигена и повышению его активности.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Балгимбаева Айжан Ильясовна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргалиева Светлана Садуахасовна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Ахметова Гульнази Даулетхановна Кожаков Коспан Кенжебаевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАПЛАЗМЕННОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения анаплазменного антигена, применяемого для серологической диагностики анаплазмоза животных. Способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза предусматривает заражение животных-продуцентов кровью животных - анаплазмоносителей, удаление селезенки через 21-30 дней после заражения,тотальное обескровливание через 15-20 дней после Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения анаплазменного антигена, применяемого для серологической диагностики анаплазмоза животных. Известен способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза,путм заражения животныхпродуцентов кровью животныханаплазмоносителей, их спленэктомию, тотальное обескровливание,выделение и разрушение эритроцитов, и получение антигена путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге, с последующей дезинтеграцией центрифугата ультразвуком, при этом,антиген получают путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 7000 об/мин, с последующей дезинтеграцией центрифугата ультразвуком при 15-20 Гц в течение 20-30 минут до получения гомогенной суспензии, с последующей лиофилизацией. (Предварительный патент РК 14673, бюл. 8,- 2004. МКИ А 61 К 39/02). Недостатком этого метода получения антигена для серологической диагностики анаплазмоза является недостаточный выход целевого продукта и низкая его активность. Целью изобретения является повышение выхода и серологической активности антигена. Эта цель достигается путем 5-6 кратной ультразвуковой дезинтеграции анаплазм с последующим центрифугированием взвеси разрушенных клеток и отделением целевого продукта в виде надосадочной жидкости. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода и улучшении качества целевого продукта, повышении эффективности диагностики. Способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза предусматривает заражение животных-продуцентов кровью животных- анаплазмоносителей, удаление селезенки через 21-30 дней после заражения,тотальное обескровливание через 15-20 дней после спленэктомии(паразитемия 80-90),скармливание животному, в период после заражения и до обескровливания,железосодержащих препаратов (с целью снижения анемии), отмывание эритроцитов физиологическим раствором ( 7,07,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости,разрушение их пятью объмами дистиллированной воды с последующим замораживанием и оттаиванием,выделение анаплазм путм ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 7000 об.,дезинтеграцию центрифугата ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 2030 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим 2 центрифугированием при тех же параметрах. Далее,процедуру повторяют до полного истощения осадка(5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Пример получения анаплазменного антигена. А. Техника получения инвазированных эритроцитов. 1. Из вены овцы - анаплазмоносителя берут 20 см 3 крови, добавляют к ней 40 мг трилона-Б(2 мг/см 3) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированной анаплазмозом овце. На 2130 день этому животному удаляют селезенку для усиления парази-темии. После операции и до тотального обескровливания животному с целью снижения влияния анемии скармливают препарат железа сульфат (200-300 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены анаплазмами (обычно на 20-30 день), животное тотально обескровливают. 2. Из вены коровы (бычка) - анаплазмоносителя берут 100 см 3 крови, добавляют к ней 40 мг трилона-Б (2 мг/см 3) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированному анаплазмозом бычку (возраст 6-12 мес.). На 21-30 день этому животному удаляют селезнку для усиления паразитемии. После операции и до тотального обескровливания животному, с целью снижения влияния анемии скармливают препарат железа сульфат (300-500 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены анаплазмами (обычно на 20-30 день), животное тотально обескровливают. Б. Техника получения анаплазменного антигена. Полученную кровь обрабатывают трилоном - Б(2 мг/ см 3). Эритроциты отмывают физиологическим раствором ( 7,0-7,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости. Один объм отмытых эритроцитов смешивают с пятью объмами стерильной, нейтральной дистиллированной воды. Смесь выдерживают 2 часа при 4 С, затем фильтруют через стерильный двойной марлевый фильтр и центрифугируют при 7000 об., в течение 30 минут. Полученные осадки соединяют в один флакон с бусами, тщательно встряхивают и отмывают дистиллированной водой при повторном центрифугировании,затем подвергают замораживанию-оттаиванию,и 3-кратному центрифугированию-отмыванию до полного просветления надосадочной жидкости. После последнего центрифугирования осадок собирают во флакон, разводят стерильным физиологическим раствором ( 7,0-7,2), в половинном объме от количества отмытой паразитарной массы, и в течение 8-12 минут центрифугат подвергают дезинтеграции ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2,с последующим центрифугированием дезинтеграта при 800010000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием дезинтеграта при тех же параметрах. Далее, процедуру повторяют до полного истощения осадка (5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Антиген разливают в ампулы по 1 см 3, срок годности его 1 год, может быть продлн после проверки его в реакции ИФА, РНГА. Антиген контролируют на стерильность,используя специальные питательные среды(отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РНГА и ИФА. Первоначальные исследования проводили в сравнительным аспекте с антигеном, полученным по ранее принятой методике. В результате была установлена более высокая активность и стабильность полученного антигена. Дальнейшее применение анаплазменного антигена более чем в 500 пробах серологических реакций подтвердили эффективность препарата. Антиген выпускают с четырехкратным запасом активности для предотвращения технических погрешностей при постановке реакции. Сравнительные данные по существующему и предлагаемому способам изготовления анаплазменного антигена приведены в таблице 1. По данным таблицы 1 видно, что предлагаемая технология получения антигена, способствует более высокому выходу анаплазменного антигена и повышению его активности. Таблица 1 Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующая (способ) технология получения Обработка анаплазм ультразвуком в течение 2030 минут при 15-20 КГц до получения гомогенной суспензии, с последующей лиофилизацией. Предлагаемая технология (способ) получения Обработка ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием дезинтеграта при тех же параметрах. Далее процедуру повторяют до полного истощения осадка (5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают Выход антигена выше в 3 - 4 раза Активность антигена при титрации выше в 1,5-2 раза отличающийся тем, что центрифугат подвергают дезинтеграции ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости,ресуспендированием осадка с повторной дезинтеграцией центрифугата при тех же параметрах, повторением процедуры до полного истощения осадка (5-6 раз), смешиванием партии надосадочной жидкости. Способ получения анаплазменного антигена для серологической диагностики анаплазмоза, путем заражения животных-продуцентов кровью животных- анаплазмоносителей, их силенэктомию,тотальное обескровливание,выделение и разрушение эритроцитов и получение антигена путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге, с последующей дезинтеграцией центрифугата ультразвуком, Верстка А. Сарсекеева Корректор Е. Барч 3