Cпособ получения трипаносомозного антигена

(51) 61 39/00 (2006.01) 61 39/005 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения трипаносомозного антигена предусматривает заражение возбудителем трипаносомоза собак,взятие крови,центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, отделение трипаносом от форменных элементов крови и дезинтеграции трипаносом ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием при тех же параметрах. Далее процедуру повторяют до полного истощения осадка(5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Предлагаемый способ способствует более высокому выходу трипаносомозного антигена и повышению его активности.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Балгимбаева Айжан Ильясовна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргалиева Светлана Садуахасовна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Ахметова Гульнази Даулетхановна Кожаков Коспан Кенжебаевич(54) ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРИПАНОСОМОЗНОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения трипаносомозного антигена, применяемого для серологической диагностики трипаносомоза животных. Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения трипаносомозного антигена, применяемого для серологической диагностики трипаносомоза животных. Известен способ получения трипаносомозного антигена для серологической диагностики трипаносомоза, путем заражения возбудителем трипаносомоза собак,получения крови,центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, отделение трипаносом от форменных элементов крови, с последующей дезинтеграцией трипаносом ультразвуком при этом антиген получают путем дезинтеграции трипаносом ультразвуком при 22 КГц в течение 30 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 6000 об/мин в течение 30 мин и сбором надосадочной жидкости. (Инновационный патент РК 21669, бюл. 9,- 2009. МКИ А 61 К 39/00,39/005). Недостатком этого метода получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза является недостаточный выход целевого продукта и низкая его активность. Задачей изобретения является повышение выхода и серологической активности антигена. Задача достигается путем 5-6 кратной ультразвуковой дезинтеграции трипаносом с последующим центрифугированием взвеси разрушенных клеток и отделением целевого продукта в виде надосадочной жидкости. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода и улучшении качества целевого продукта, повышении эффективности диагностики. Способ получения трипаносомозного антигена предусматривает заражение возбудителем трипаносомоза собак,взятие крови,центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, отделение трипаносом от форменных элементов крови и дезинтеграции трипаносом ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием при тех же параметрах. Далее процедуру повторяют до полного истощения осадка(5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Пример получения трипаносомозного антигена. А. Техника получения трипаносом. Материалом для получения трипаносомозного антигена служит кровь собак, зараженных эталонным штаммом трипаносом или одним из вирулентных штаммов,выделенных от сельскохозяйственных животных. Для этого полученный штамм поддерживают на белых мышах,с перезаражением 2 раза в неделю. При необходимости получения антигена первоначально заражению подвергают белых крыс путем 2 подкожного введения 3-4 крысам по 0,5 см 3 цитратной крови. После появления в периферической крови большого количества трипаносом (90 и более в поле зрения), что обычно бывает на 3-4 сутки после заражения, их обескровливают. Собак заражают внутрибрюшинно в среднюю треть живота вблизи белой линии, вводя 40-50 см 3 цитратной крови (от 4-5 крыс), в зависимости от размера животного. На 2-3 день заражения у собак в периферической крови появляются трипаносомы, количество которых периодически нарастает или уменьшается. Собак необходимо обескровливать в момент первого накопления трипаносом, когда при микроскопическом исследовании крови их находят не менее 80 в поле зрения. Обескровливание проводят путем взятия крови из сонной артерии. При этом всю вытекающую струей кровь собирают в широкий сосуд с 2-ным цитратом натрия на физиологическом растворе при постоянном перемешивании стеклянной палочкой, из расчета 1 часть крови на 2 части раствора. Полученную после обескровливания собак цитратную кровь фильтруют через двойной марлевый фильтр, в стерильные банки, которые затем ставят в холодильник на 18-24 часа. Отстоявшийся цитрат и плазму отсасывают шприцом в отдельную банку, а осадок тщательно размешивают и подвергают центрифугированию. Центрифугирование производят в предварительно прокипяченных стаканчиках емкостью 80-100 см 3 в течение 15-20 минут при 2-3 тысячах оборотов в минуту. В результате центрифугирования в стаканчике образуется три слоя верхний прозрачный, желтоватый, состоящий из плазмы и цитрата нижний - форменные элементы крови, а на границе между ними - средний, в виде толстой рыхлой массы белого цвета, состоящий из трипаносом. Верхний слой сливают в банку,а трипаносомную массу вынимают при помощи стеклянной палочки или шпателя и переносят в отдельную посуду. Всю собранную трипаносомную массу отмывают 2-3-х кратно, в физиологическом растворе, при 3000- 5000 об/мин, по 10 минут каждое. Б. Техника получения антигена из пироплазмид. Полученную трипаносомную массу подвергают дезинтеграции ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см 2,с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием дезинтеграта при тех же параметрах. Далее процедуру повторяют до полного истощения осадка (5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают. Антиген разливают в ампулы по 1 см 3, срок годности его 1 год, может быть продлен после проверки его в реакции ИФА, РНГА. Антиген контролируют на стерильность,используя специальные питательные среды грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РНГА и ИФА. Первоначальные исследования проводили в сравнительном аспекте с антигеном, полученным по ранее принятой методике. В результате была установлена более высокая активность и стабильность полученного антигена. Дальнейшее применение трипаносомозного антигена более чем в 500 пробах серологических реакций подтвердили эффективность препарата. Антиген выпускают с четырехкратным запасом активности для предотвращения технических погрешностей при постановке реакции. Сравнительные данные по существующему и предлагаемому способам изготовления трипаносомозного антигена приведены в таблице 1. По данным таблицы 1 видно, что предлагаемая технология получения антигена, способствует более высокому выходу трипаносомозного антигена и повышению его активности. Таблица 1 Сравнительные данные по технологии получения антигена Существующая (способ) технология получения Обработка трипаносом ультразвуком в течение 30 минут при 22 КГц, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 6000 об/мин в течение 30 мин и сбором надосадочной жидкости ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения трипаносомозного антигена для серологической диагностики трипаносомоза,путем заражения возбудителем трипаносомоза собак, получения крови, центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости,отделение трипаносом от форменных элементов крови, с последующей дезинтеграцией трипаносом ультразвуком,отличающийся тем,что трипаносомы подвергают дезинтеграции Предлагаемая технология (способ) получения Обработка ультразвуком при частоте 22 КГц,мощности 60 Вт/см в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости. Осадок ресуспендируют и подвергают повторной дезинтеграции с последующим центрифугированием дезинтеграта при тех же параметрах. Далее процедуру повторяют до полного истощения осадка (5-6 раз). Партии надосадочной жидкости смешивают Выход антигена выше в 3 - 4 раза Активность антигена при титрации выше в 1,5-2 раза ультразвуком при частоте 22 КГц, мощности 60 Вт/см 2 в течение 8-12 минут, с последующим центрифугированием дезинтеграта при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин и сбором надосадочной жидкости, ресуспендированием осадка с повторной дезинтеграцией центрифугата при тех же параметрах, повторением процедуры до полного истощения осадка (5-6 раз), смешиванием партий надосадочной жидкости.