Штамм Escherichia coli – продуцент L – треонина .

2 Изобретениечотносится к микробиологической промыш ЛЭННОСТИ И касается НОВОГО ШТЗММЭ. бактерий, ПРОДУШРУЮЩЭГО ЗМИНОкислоту треонин. Ьтреонин является незаменимой аминокислотой, которан применяется как компонент различных питательных смсссй модицинского назначения. Кроме того, треонин может быть использован в качестве добавки в корма животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности и как ростовой фактор для микроорганизмов, продуцирующих другие аминокислоты, например лизин и гомосерин. ОНаилучшим по Уровню биосинтеза треонина и расходному коэффициуенту является штамм Е.оо 11 ВНИИгенетикаб 40 который в лабораторных ферментерах при культивировании в условиях подачи в питательную ц среду по сигналу датчика рН сахаро-аммиачной подпитки синтезирует за 36 ч до 85 г/л треонина с расходным коэффициентом 2 г сахара на 1 г треонинаНедостатком штамма Вниигенетика-640 является его низкая продуктивность на средах, в которых в качестве источника углерода и энергии используется меласса - дешевое, непишевое сырье. Этод Не достаток связан с неполной.ауксотрофностью штамма по изолейцину которая хотя и обеспечивает высокую продуктивность штамма при росте на минимальных питательных средах, но существенно сникает скорость роста бактерий в этих условиях, особенно на начальных этапах культивирования. Обогащение питательной среды аминокислотами (особенно изолейцином) ускоряет рост штамма, но значительно снижаетстимулирующий эффект изолейциновой ауксотрофности на продукциютреонина. Целью изобретения является новый штамм ба эрий позволяющийполучать высокий выход треонина вуслоьяцх бо. ого числа генераций бактериальной культуры на средах о меласса являющейся более дешевым сырьем, чем сахар. Предлагаемыйнсвый а змм Е.со 11 ВКПМ В 5 З 18 позволяет за З 2 ч.- синтезировать до 7 л г/л треонина на средах с мелассой. При этом расходный козффицичмт составляет 1,7. Новый штамм Е.со 11 ВКПМ В 5 З 18 получен путем трансформации нового реципиентного штамма Е.со 1 Вниигенетика ТДГ 7 новой плаз мидой рРЕТб 14. Плаамида рРЕТ 614 получена путем замены регуляторнойзоны треонинового оперона плазмиды рУ 1 с 4 О на промотор и температурочувствительный репресоор фага лямбда (фиг.1 З). .В Качестведонора промотора и репрессора использовалась плазмида рРН 4 ОНовый реципиентный штамм Е.со 11 Вниигенетика ТДГ 7 прототрофный по изолейцину получен из бесплазмидных клеток штамма Е.со 11 ВНИИР генетика тДГ 6 . Для этого бесплазмидные клетки штамма Е.со 1 ВНИИгенетика ТДГ 6 заражают фагом Р 1, размноженным на клетках штамма Е.со 11 Сб 0 О и отбирают трансдуктапты способные расти на средах, по содержащих изолсйципа. Отобранные клетки штамма, полумНовый штамм Е.со 11 ВКПМ В 5 З 18 отличается от известного штаммаН тем, что способен на обогащенных питательных средах, например насредах с мелассой к более эффективной продукции треонина с высоким коэффициентом конверсии. Это позволяет использовать более дешевое сырье (мелассу) для синтеза треонйна. Данное отличие являет ОЯ результатом ДВУХ изменений, ВНЭСЭННЫХ В ШТаММ-ПРОТОТИП ЗЗМЭНОЙрегуляторной зоны треонинового оперона на плазмиде рЧ 1 с 4 О промотаром и репрессором фата лямбда, а также внесением изолеициновон прототрофности в штаммреципиент. Предлагаемый штамм позволяет получать более 70 г/л треонина за 32 ч ферментации на мелассе в лабораторных условиях в температурном интервале 38 41 О.Новый продуцент треонина Е.со 11 ВКПМ В 5318 депонирован 2 коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков и имеет регистрационныи М 2 О 7 О, а также во Всесоюзнои коллекции промышленных микроорганизмов (регистрационный МВКПМ В 5 З 18).Новый штамм Е.со 11 ВНПМ В 5 З 18 имеет следующие культуральноморфологические и биохимические признаки.Морфология клеток. Грамотрицательные слабоподвижные палочки сМясопептонный агар. Через 24 ч роста при 79 образует круг лые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 3,0 мм поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колонии приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется, Агар Луриа. Через 24 ч роста при З 7 С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 2,5 мм поверхность колонии гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.Агаризованная среда Адамса. Через 40 - 48 ч роста при 37 С образует колонии диаметром 0,5 1,5 мм сероватобелые полупроз речные, ОЛЭГКЗ ВЫПУКЛЫЭ С блестящей поверхностью.. 5 . . О РОСТ В МЯСОЧТЭПТОННОМ бУЛЬОНгЭ. Удельная скорость роста при 37 СРост по уколу В мясопептонном агаре. Хороший рост по всему уколу. Микроорганизм является факультативным анаэробом.Рост на молоке хороший с коагуляцией молока.Отношение к температуре. Растет на мясопептонном бульоне при 4 зС и ниже. Оптимальной является температура 37 38 С.Отношение к рН среды. Растет на жидких средах с рН от 6,0 до 8,0. Оптимальное значение рН 7,0. Отношение к источникам углерода. Хорошо растет на сахарозе,глюкозе, фруктозе, лактозе, маннозе, галактозе ксилозе глицерине манните с образованием кислоты и газа.Отношение к источникам азота. усваивает азот в форме аммония,нитратов, а также азот некоторых органических соединений.Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибриднуюстрептомицину и несущую гены треонинового оперона, промотор фата лямбда и ген температурочувствительного репрессора С 1. Устойчивость к ингибиторам. Устойчив к Ьтреонину и Ь-гомосери ну. Стабильность плазмиды. Штамм Е.со 11 ВКПМ Вг 5 З 18 характеризуется высокой стабильностью плазмиды даже при росте В отсутствии се лекции, направленной на поддержание плазмиды. Оценку стабильности