Способ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в Escherichia coli

НАЦИОНАЛЬНОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО ПРИ КАБИНЕТЕ МИНИСТРОВ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАНИзобретение относится к генетической ИНЖЗНСОИИ. В ЧЕСТНОСТИ К СИНТЕЗУ МИТОГЕН ного зндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК.Фактор роста зндотелиальньтх клеток(ФРЭК) является митогеном эндотелиапы ных клеток Еп что.ФРЭК выделяют путем осаждения сульфатом стрептомицина гель проникающей хроматографией. осаждения сульфатом амь мония и аффинной хроматографией на гепаринтсефарозе.Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем злюирования его линейным градиентом натрийхлорида из колонки на гепарин-сефарозе или обращенноьфазовой высокожидкостной хроматографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида. обозначенные альфа- и бетаФРЭК. имеют мол.м. 17000 и 20000. Используя указанную методику. бычий ФРЭК. содержащийся в 8500 мл вытяжки из мозга быка (625 к 107 суммарных единиц). концентрируют с выходом а сумме 6 мл альфа(54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ МИТОГЕННОГО БЕЛКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ЕЗСНЕШСША СОЦ(57) Изобретение относится к генетической ИНЖЕНЕРИИ. В ЧЕСТНОСТИ К СИНТЕЗУ МНТОГВНного зндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК. конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК. кодьтрующие фактор роста эндотепиальных клеток человека, трансформируют полученными ДНК штаммы реципиентов Е. сон. культивируют трансформанты в условиях. обеспечивающих экспрессию белка. и выделяют целевой продукт.Сущность изобретения состоит в получении ФРЭК и его фрагментов. не содержащих других белков человеческого происхождения. ФРЭК получают в клетках-реципиентах. при этом конструируют векторы экспрессии. содержащие последовательность ДНК. кодирующую ФРЭК, трансформируют полученными рекомбинантами ДНК штаммы Е. соН клеток хозяев. осуществляют культивирование трансформаторов в условиях. обеспечивающих экспрессию ФРЭК. и выделяют белок. Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получения дн-кДНК из мРНК ФРЭК и введения днкДНК в вектор. мРНК обогащают попи(д)содержащим мРНК материалом посредствомхроматографии на олигоншцеллюлозе или полимсефарозе с последующим злюированием фракции мРН К. содержащей поли(дпоследоватепьность.Полиичсодержащую мРНК используют для синтеза комплементарной кДНК (онкДНК). используя обратную транскриптазу.В результате синтеза ДНК у 3-конца ДНК ОБПЗЗУЭТСЯ шпилечная петля. инициирующая синтез двунитевои ДНК. При соответствующих условиях эту шпилечную петлю используют для осуществления синтеза днкДНК в присутствии полимеразы и деоксирибонуклеотидтрифосфатов.Вектор экспрессии обрабатывают с помощью андонуклеазы рестрикции. которая образует по крайней мере два тупых или липких конца. Дн-кдНК встраивают в вектор.Клоны. содержащие полные последовательности ФРЭК. идентифицируют, используя в качестве зонда вставку кДНК рекомбинантов ФРЭК. выделенных во время начального скриннинга библиотеки кДНК рекомбинантного фрагмента фата лямбда с олигонуклеотидами. специфическими к ФРЭК. Метод секвенирования нуклеотидов используют для определения последовательности аминокислот, кодированных фрагментами кДНК. Эту информацию можно использоаать для определения клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной аминокиспотой посл едовательностью аминоконца бычьего ФРЭК и пептида. выделенного в результате расщепления ФРЭК бромидом цианогена.П р и м е р. А. Получение тотальной РНК, Тотальную РНК (матричную. рибосомную и транспортную) экстрагируют из вытяжки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугирования гомогенизируют в 5 объемах раствора. содержащего 4 М тиоцианата гаунидина и 25 мМ антивспенивателя А. Гомогенат центрифугируют в роторе в течение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10 С. Надосадочную жидкость доводят до рН 5.0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК. осажденной 0.75 объемами этанола при 20 С в течение 2 ч. РНК собирают центрифугированием и растворяют в 7.5 М гидрохлорида гуанидина. содержащего 2 мм цитрата натрия и 5 мМ дитиотреитола. после двух дополнительных осаждений 0.5 объемами этанола оставшийся хлоргидрат гуанидина экстрагируют из преципитата абсолютным этанолом. РНК растворяют в стерильной воде, центрифугированием удаляют нерастворимые вещества и осадок после центрифугирования повторно экстрагируют водой. РНК доводят до концентрации 0.2 М ацетата калия и осаждают при добавлении 2.5 объемов этанола в течение ночи при -20 СПреципитат тотальной РНК растворяют в 20 мм Нарва-буфера (рН 7.2), содержаще 4затем быстро охлаждают до 25,. Раствор РНК затем разбавляют равным объемом водьг и прибавляют МаС для доведения конечнои концентрации до 300 мм ЫаСОбразцы. содержащие до 240 А 2 гп единиц РНК. кроматотрафируют на полщщсефарозе. ПолиА)с 0 Держаи.1 ую РНК элюируют 70 раствором формамида. состоящим из 1 мМ Нарве-буфера (рН 7.2 и 2 мм ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0,24 М НаС и полученную РНК осаждают 2.5 объемами этанола при -20 С.В. Конструирование клонов кДНК в фаге лямбда.мРНК (20 мкг копируют в днкДНК с помощью транскриптазы и ДНК-полимеразы. дн-кДНК обессоливают на сефадексе Ст 50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищают на колонке в соответствии с инструкциями изготовителя. При инкубации с Ы-нуклеазои получают днкДНК с тупыми концами. Реакционную смесь. состоящую из 0.2 М цитрата натрия(рН 4.5). 0.4 М хлорида натрия. 2.5 мм ацетата цинка и 0.1 ед ЕН-нуклеазы на нг дннДНК. доводят до конечного реакционного объема 100 мкг. дн-дДНКчлнкубируют при 37 С в течение 1 ч. экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе 6-50.Дн-кДНК затем обрабатывают метилаэои Е. соН и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1. кДНК опять обессоливают на сефадексе 6-50. а затем лигируют с 0.5 мкг фосфорипированных линкеров Е. сот. используя Т 4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепляют эндонуклеазои рестрикции Е. сот и фракционируют в 8 акриламидном геле в трис-боратном буфере, ДНК размером более 1 кб элюируют из геля и извлекают при связывании с колонкой. элюируют 1 М МаС. а затем собирают преципитациеи этанолом.Фрагменты ДНК затем вставляют в фрагмент 9111 Фата лямбда. расщепленного рестриктазои Е. сот и обработанного фосфатазои, используя ДН К-лигаау Т 4. Получают библиотеку. состоящую из 5.7 х 10 фагов,65 которой составляют рекомбинантные фаги. Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42 С на штамма Е. соН У 1088 (сир-Е зирР ттс В тгр В неон паст м топ А 21 ш А ас и 169(ргосТп 5). К важным генетическим признакам указанного штамма относятся (1) сир Р(необходимый для супрессии амбе мутации фаза по З-гену. (2) лзо К тво М . необходимые для предотвращения рестрикциичужеродной ДНК до модификации клеткихозяина и (З) ас И 169 (ргос т Тп 5). и (4) рМС 9(Ьас 1-несущое производное плазмиды рВН 322. которое подавляет в присутсте вии индуктора экспрессию чужеродных генов. которые могут разрушать Фаг и/или подавлять клеточный рост.Для скриннинга библиотеки кднк ФРЭК. содержащей рекомбинантные фаги. клетки фагов с титром 1.5 х 105 высевают на чашке на газон штамма Е соН У 1 О 90 А ас И 169 рго А Аоп ага 0139 зтг А вор Р тгр С 22 Тп 10(рМС 9) и инкубируют при 42 С в течение б ч. После охлаждения чашек в холодильнике в течение ночи их накрывают нитроцеллюлозным фильтром. Положение фильтра маркируют иголкой, Через минуту фильтр удаляют и дают просохнуть при комнатной температуре. С каждой чашки получают двойной фильтр. кроме того. что фильтр ОСТЭВЛВЮТ В КОНТНКТЭ С ЧНЦКОЙ В ТВЧЕНИЭ 5 мин. Затем готовят все фильтры для гибрид дизации. Указанная методика включает де натурацию ДНК в 0.5 М МаОН с 1,5 М ЫаСЪ нейтрализацию в буфере 1 М трис-НС. рН 7.5. и 1.5 М наст и нагревание фильтров в течение 2 ч в вакууме при 80 С.Для скриннинга библиотеки кДНК ствола головного мозга человека для получения клонов. содержащих ФРЭК-вставки. конструируют специфическии олигонуклеотид. Указанный олигонуклеотид базируется на анализе частичной аминокислотной послеДОВЗТВПЬНОСТИ КОНЦЕВЫХ ВМИНОГРУПП ФРЭК. Бычий ФРЭК выделяют в виде двух форм. обозначенных как альфа-и бета-ФРЭК. которые отличаются только аминокислотами. обнаруженными у соответствующих аминоконцов. Последовательность выводят из масс-спектрального анализа с Быстрой атомной. бомбардировкой и определяют аминокислотный состав триптического пептида с концевой аминогруппой. По-видимому. аминоконцевая блокирующая группа ацетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином. то. как определено. вторая аминокислотная последовательность с аминоконцом. найденная в бетап а не в альфа-ФРЭК, начинается с еле Аап Ьеи данная последовательность также обнаружена у концевой аминогруппы кислого фибробластного фактора роста. концевая аминогруппа ФРЭК представляет Азл Туг Ьузи является эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой элонгации.Для конструирования олигонуклеотида выбирают последовательность аминокис 6лот Не еи РГО Азп (Ну Пи Гл Азр (Ну Ни.у 5. соответствующую 10 29 включгнням аминокислот альфао)РЭК Зместо Солдания смеси из олигонуклеотидов. охватывающих все возможные кодирукццие последовательности (вследствие деградации генетического кода). конструируют длинный уникальный олигонукпеотид. ТаКИЕ ОВИГОНУКЛВОТИДГЗЗТПЯВКИ, КЗК ПОКЭЗЗНП ранее. являются эффективными зондами при скриннинге комплекс-ДНК.При конструировании ФРЭК-зонда используют три критерия 1 исключают динуклеотидную пару СО. Данный подход основан на недостаточной встречаемости ССЗ-пар динуклеотида в ДНК прокариота. В тех случаях. когда возможно. используют данные о Предпочтительной утилизации кодона. Когда оба эти подхода не информативны. возможно необычное связывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований 6 Т 1 Т. 1 А и С. которое возникает при взаимодеистч вии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК.Примерно 30 моль олигонуклеотида рат диоактивно метят путем инкубации с 32 ргамма-АРТ и Т 4 полинуклеотид-киназой. Полученные по методике. указанной выше. нитроцеллюлозные фильтры предварительно гибридизуют при 42.С в 6 х ЗЗРЕ-буфере(1 к Денкардт-раствора содержит по 0.02 фикола. поливинилпирролидона. бычьего сывороточного альбумина. 5 растворе сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Через 4 ч вводят 42 Р-меченый олигонуклеотид и гибридизацию продолжают в течение ночи при 42 С. Негибридизованный зонд удаляют в результате последовательного промывания при 37 С в 2 х 8 РЕтбуфере и 0.1 Х, растворе ДДС натрия (503).Из скриннированных 1,5 х 10 кленов 2 клона дают положительные радиоавтографические сигналы после экспозиции а течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состояния повторными циклами очистки. используя вышеуказанный олигонуклеотид в качестве гибридизационного зонда.Два клона, которые выделены. клоны 1 и 29 ФРЭК. анализируют более детально. При переваривании с Е. сот в клонах 1 и 29 обнаруживают кдНК-вставки длиной 2.2 кб и 0.3 кб соответственно. При ниютрансляции клонированной кДНК и последующем ее использовании в качестве радиомеченого зонда в блат-гибридизации по Саузерну обнаруживают. что клоны 1 и 29 представляют собой связанные и перекрьтвающиеся клоны.Более детально клоны 1 и 29 анализируют по следующей методике. Конструируют два дополнительных олигонуклеотида на основе аминокислотной последовательности бычьего ФРЭК. Указанные олигонуклеотиды конструируют на основе таких же подходов. которые используют при конструировании олигонуклеотида,применяемого для выделения клонов 1 и 29. Эти два нуклеотида, а также олиго(сТ)1 в радиоактивно метят в киназной реакции. как указано выше. и затем используют в качестве гибридизационных зондов в блот-анализе по Саузерну. Полученные данные этого анализа показывают, что кдНК-вставка 0.3 кб клона 29 гибридизуется с и Н олигонуклеотидами ФРЭК. а не с Н или олиго(оГ 1 З-нуклеотидами кДНК-вставка 2,2 кб клона 1 гибридизуется с П, П олигонуклеотидами. а также с олигоШПтв-нуклеотидом.Из этих данных и последующего определения нуклеотидной последовательности клонов 1 и 29 видно. что 3 конец клона 1 заканчивается полиА-хвостом. При гибридизации клона 1 с олигонуклеотидом 11 ФРЗ К. которая происходит на основе вырегзания цианогенбромидом продукта бычьего ФРЭК. а также с олиго оПтв-нуклеотидом указанный клон. как предполагают. включает оставшуюся кодирующую последовательность для альфа- и бета-форм ФРЭК. а также длинную (более 1 ко) СГ-концевую фланкирующую последовательность.Из клонов 1 и 29 выделяют кДНК-вставки. субклонируют в М 13 р 18 а открытую рамку считывания, кодирующую ФРЭК. и фланкирующиеся области секвенируют по методу терминации цепи. При анализе нуклеотидной последовательности обнаруживают открытую рамку считывания из 464 нуклеотидов. кодирующую ФРЭК человека. Установлено. что 155 аминокислот ФРЭК человека фланкированы кодонами блокировки трансляции. Аминокислотой с концет вой ННггруппой бета-ФРЭК человека. выделенной из кДНК-последовательности,является метионин. который. по всей вероятности. выступает в качестве остатка инициации трансляции. На основе указанных данных, а также с негидрофобной природой первых 15420 аминоконцевых остатков высказывается предположение. что бета-ФРЭК человека синтезируют без сигнального пептида с концевой Мнг-группой. Аминокислотная последовательность с концевой аминогруппой бычьего бета-ФРЗК. расщепленная трипсином. а также бычьегоальфа-ФРЭК идентична аминокислотной последовательности. выведенной из последовательности нуклеотидов клонов 1 и 29 лямбда ФРЭК. Полная гомология между ДВУМЯ УКЗЗЗННЫМИ ВИДЗМИ. как уСТЭНОВПВНО. составляет более 95.При МоПЬегп-бпот-анализе устанавливают, что мРНК ФРЭК представляет вид единичной молекулы. которая мигрирует вместе с 28 5 рРНК. С учетом допускаемой погрешности в расчетном размере 28 З рРНК приблизительный размер мРНК ФРЭК составляет 4.8 11,4 кб. Последовательности. кодирующие зрелые формы как альфац так и бета-ФРЭК. закодированы в пределах клонов 1 и 29 ФРЭК, которые вместе имеют размер примерно 2.3 ко. Таким образом. указанные данные демонстрируют. что область 5 и фланкирующая последовательности. кодирующие ФРЭК. довольно протяженные (примерно 2.5 11,4 кб.Из клонов 1 и 20 вырезают кДНК-вставки посредством гидролиза Е сот и субклонируют в ру 08 у сайта Е сот. Плазмиду. сконструированную из клона 1. обозначают как рОН 13. а плазмиду. образованную из клона 29. как рО НМ. Указанные плазмиды депонируют в Американской коллекции ти повых культур. 12301 РагИашп Огйуе. Носки АТСС 20852. Плазмиде из клона 1. то есть рЕ) Н 15 присваивают номер АТСС 53336. а плазмиде из клона 29. то есть рВ Н 14, АТСС 53335.Таким образом. указанный пример представляет экспериментальные методики. которые предусматривают получение фактора роста зндотелиальных клеток человека, не содержащих других белков человеческого происхождения.ФРЭК применяют для выращивания и амплификациии зндотелиальньтх клеток в культуре. В настоящее время ФРЭК. используемый для выращивания клеток. экстрагируют из бычьего мозга, Этот неочищенный бычий ФРЭК является митогеном эндотелия аллантоисной вены человека. Использование гепарина с ФРЭК и матрикса на основе фибропектина позволяет получить стабильные кпоны эндотелиальных клеток. Рекомендуемая концентрация сырого бычьего ФРЭКдля использования в качестве митогена до что составляет 150 мкг на мл питательной среды.Рекомбинантный ФРЭК человека. полученный таким образом. пригоден в качестее замены бычьего неочищенного ФРЭК при культивировании Ел упго зндотелиальных клеток человека и других мезенхимнык клеток для научных исследований. Полага