Способ получения аллерген-вакцины из бруцелл

(51) 61 39/10 (2006.01) 61 43/00 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ температуре 37,5 С, смыв бактериальный массы физиологическим раствором поваренной соли и приготовление микробной взвеси с последующей лиофилизацией, готовят взвеси бруцелл 50,0100,0 млрд концентрации из штаммов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270 на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения,после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт. Аллерген-вакцина из бруцелл, в бактериальную взвесь живых бруцелл в конечной концентрации перед лиофилизацией добавляют Аллерген-вакцина из бруцелл, в бактериальную взвесь живых бруцелл в конечной концентрации перед лиофилизацией добавляют ультразвуковой лизат-1 В-0268 в количественном соотношении лизата и полученной суспензии 12, затем бактериальную массу разводят физиологическим раствором до концентрации 2109 КОЕ/мл, после чего лиофилизируют и используют в качестве целевого продукта.(72) Иванов Николай Петрович Тен Виктор Борисович Арысбекова Алтынай Танибергеновна Оспанов Ержан Калиолдинович Бакиева Флюра Альбертовна Саримбекова Сауле Нургалиевна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Хорьков И.А. Дезинтеграция бруцелл ультразвуком при промышленном производстве диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Москва,1978,с.174-175(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНВАКЦИНЫ ИЗ БРУЦЕЛЛ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к получению биологических препаратов и может быть использовано для изготовления аллерген-вакцины,не обладающих,сенсибилизирующими свойствами и может найти широкое применение в ветеринарной практике для диагностики и профилактики бруцеллеза. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается повышением чувствительности и специфичности аллергена,получаемого из бруцелл. Аллерген-вакцина из бруцелл, включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл, автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием,выращивание бруцелл на эритрит-агаре при Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к получению биологических препаратов и может быть использовано для изготовления аллерген-вакцины,не обладающих,сенсибилизирующими свойствами и может найти широкое применение в ветеринарной практике для диагностики и профилактики бруцеллеза. Известен аллерген-вакцина из бруцелл,включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием, выращивание бруцелл на эритрит-агаре при температуре 37,5 С, смыв бактериальный массы физиологическим раствором поваренной соли и приготовление микробной взвеси с последующей лиофилизацией Хорьков И.А. Дезинтеграция бруцелл ультразвуком при промышленном производстве диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Москва, 1978, с.174-175. Недостатками этого способа является относительно малый выход активных начал,длительность и сложность процесса приготовления. Задачей изобретения является создание аллергенвакцины из бруцелл для диагностики и профилактики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается повышением чувствительности и специфичности аллергенвакцины, получаемого из бруцелл. Аллерген-вакцина из бруцелл, включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл, автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием,выращивание бруцелл на эритрит-агаре при температуре 37,5 С, смыв бактериальный массы физиологическим раствором поваренной соли и приготовление микробной взвеси с последующей лиофилизацией, готовят взвеси бруцелл 50,0100,0 млрд концентрации из штаммов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270 на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения,после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт, после чего, в бактериальную взвесь живых бруцелл в конечной концентрации перед лиофилизацией добавляют ультразвуковой лизат-1 В-0268 в количественном соотношении лизата и полученной суспензии 12, затем бактериальную массу разводят физиологическим раствором до 2 концентрации 2-109 КОЕ/мл,после чего лиофилизируют и используют в качестве целевого продукта. Для изготовления используют штаммы-1-0268,19 В-0269 и 61 В 0270. Штаммы характеризуются следующими признаками. Происхождение штаммов бактерий Штамм 0268 Штамм бактерии родавыделен Эльбергем и Фенсом из организма производителя в 1953 году, путем высева из патологического материала на питательную среду - Альбими с добавлением в нее стрептомицина. Идентифицирован по определителю бактерий,2005,, . 370-386. Назначение штамма бактерий. Штамм предназначен для приготовления вакцины и диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Агар Д, эритрит агар, среда Альбими. Т 37-38 С,среда Белабаба. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, Т 37-38 С, в течение 48 часов в термостате. Микроккоки, длиной 0,4-2,2 мкм, шириной 0,40,6 мкм, неподвижные, очертания концов округлые,по Граму не окрашиваются, (имеет красный цвет) окрашиваются по методу Козловского, не кислотоустойчивы, тип размножения деление. Размер двух-терх-суточных колоний 1,0-2,0 мм,круглые, плотные, гладкие, прозрачные и телесные в отражением света. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма условный аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразит, фагом Тб не лизируется. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы-цистеин, цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, уреаза,оксидаза, не образует сероводорода и индола, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Растет на эритритагаре, среде Альбими, Белобаба находится стабильный -форме, в -форму при выращивание на других не растут на добавлением стрептомицина,не выделяет сероводород, обладает каталазной и оксидазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Штамм-1 В-0268 хранят на твердой питательной среде в сухом виде соответственном в пробирках или запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 34 месяца. Штамм 19 В-0269 Штамм бактерии получен абортированного плода БЭК-ом в 1923 году. Идентифицирован по определителю бактерий,2005,, . 370-386. Назначение штамма бактерий. Штамм вакцинный для приготовления профилактических диагностических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Эритрит агар, Бактериологический анар, среда Беллебаба, гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид, агар-агар. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, То 37-38 С, в течение 48 часов. Овоиды, длиной микроккоки размером 0,42,2 мм, 0,4-0,6 мкм, неподвижные, очертания концов округлые,по Граму не окрашиваются,окрашиваются по методу Козловского, не кислотоустойчивы, тип размножения деление. Размер колоний 2,0-5,0 мм, круглые, гладкие,холмиком, края ровные, с обратной стороны в проходящем свете янтарные, прозрачные -форма,колоний плотные, гладкие. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком, рН-6,8-7,2. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразит. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин, цестеин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, оксидаза,умеренно образует сероводород и индол, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Не растет на средах с содержанием пенициллина, штамм находится в стабильной -форме, умеренно обладает каталазной и уреазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Вакцинный штамм 19 В-0269 хранят в сухом виде в запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Штамм 61 В 0270 Штамм бактерии получен в 1957 году, в лаборатории Вейбридж (Англия). Идентифицирован по определителю бактерий Назначение штамма бактерий. Вакцинный штамм предназначен для приготовления диагностических профилактических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Агар Д, эритрит-агар с добавками, МППГГА. Т 3738 С. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит агаре, То 37-38 С, в течение 48 часов. Коккобактерии, палочковидной формы, длиной 0,6-3,0 мкм, шириной 0,4-0,8 мкм, неподвижные,очертания концов округлые, по Граму не окрашиваются,окрашиваются по методу Козловского,не кислотоустойчивы,тип размножения деление. Размер колоний 3-5 мм, круглые, выпуклые,гладкие с цельным краем, консистенсия плотные,гладкие, поверхность блестящая, -форма, с обратной стороны в проходящем свете янтарные,прозрачные. Рост в жидкой среде - вызывает помутнение МПБ в течение суток, образует пристеночное кольцо с голубоватым оттенком, рН-6,2-6,5. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм. Источники углерода глюкоза,глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, оксидаза,уреаза, образует сероводород, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Не растет на средах с пенициллином, обладает каталазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Вакцинный штамм 61 В 0270 хранят в сухом виде в запаянных под вакуумом ампулах при температуре от 4 до 6 С. Пересев нативных культур проводят один раз в 3-4 месяца. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Способ изготовления аллергена из бруцелл осуществляется следующим образом. Пример 1. Способ изготовления аллергена из культуры бруцелл готовят из штаммов-1 В-0268,19 - 0269 и 61 В 0270, выращивают на эритритагаре, смывают с питательной среды стерильный физиологическим раствором, отмывают им от остатков питательных среды. Затем готовят взвеси бруцелл 50,0-100,0 млрд концентрации из штаммов,на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения, после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора 3 трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 2030 минут, затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0,стерилизуют автоклавированием при температуре 1,0 амт в течение 30 мин и получают целевой продукт. Установлено, что у полученных описанным способом препаратов сохраняется способность вызывать аллергическую реакцию организма животных зараженных всеми видами бруцелл. Срок годности готового препарата не менее 18 месяцев. Активность и специфичность полученного описанным способом аллергена была проверена в лабораторных и производственных условиях. Полученные при этом данные указывают на высокую активность и специфичность препарата,что позволяет дополнительно выявлять до 10 больных животных. Пример 2. При изучении сенсибилизирующих и антигенных свойств полиштаммного аллергена берут 20 здоровых морских свинкам и вводят аллерген в дозе 0,5 см 3 подкожно в область средней трети брюшка. Далее указанным животным было проведено 5 кратное введение аллергена внутрикожно с интервалом 2-3 дней. Через 10 и 15 дней после введения берут кровь для серологических исследований. Учет аллергических и серологических реакций производят в РБП, РСК. При этом во всех случаях был получен отрицательный результат. При исследовании сыворотки крови с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами также получены отрицательные результаты. Таким образом, аллерген из бруцелл видов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В 0270, при 5-ти кратном введении морским свинкам в дозе 0,5 см 3 не проявляет сенсибилизирущих свойств. Эти же свойства изучали в благополучной по бруцеллезу отаре овец ТОО Байсерке-Агро. При этом 342 здоровым овцам 4-кратно с интервалом 114 дней вводят подкожно аллерген в рабочем разведении в дозе 0,5 см 3 нижнее веко левого глаза(пальперальная проба). Учет реакции производят через 48 часов. Все животные реагировали отрицательно. Через 2,5 месяца после начала опыта у данных животных была взята кровь для серологических исследований с коммерческими бруцеллезными антигенами. Были получены отрицательные результаты. Следовательно,полиштаммный аллерген бруцелл трех видов не проявляет сенсибилирующих и антигенных свойств при двух кратном введении морских свинок и при 4-кратном введении овцам в дозе 0,5 мл в пальпебральной пробе. Специфичность препарата проверяли в сравнении с контрольным коммерческим аллергеном в 2 опытах на искусственно сенсибилизированных бруцеллами видов 4-1 В-0268,19 - 0269 и 61 В 0270, овцах. Аллергены применяли в пальпебральной пробе в дозе 0,5 мл. Реакции учитывают через 48 часов. В таблице 1 приведены результаты проверки специфичности препарата. Как видно из данных таблицы 1, полиштаммный аллерген из бруцелл трех видов проявляет более высокую активность,чем общепринятый(коммерческий) аллерген, изготовленный из бруцелл вида , применяемый для диагностики бруцеллеза овец. Так же было проведено комплексное исследование на бруцеллез в двух неблагополучных по бруцеллезу отарах овец. Всего проведено комплексное (серологическое и аллергическое) исследование на бруцеллез более 4 тысяч овец разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально утвержденные РБП и реакция РСК с коммерческими бруцеллезными антигенами. При аллергическом исследовании использовали полиштаммный аллерген из бруцелл 3-х классических видов,изготовленный путем дезинтеграции микробных клеток ультразвуком. В качестве контрольного аллергена был введен коммерческий бруцеллин. Оба аллергена вводили под кожу нижнего века левого (коммерческий бруцеллин) и правого(пальпебральная проба). Использования аллергена, изготовленного из трех штаммов бруцелл позволяет выявить в неблагополучных отарах дополнительно к общепринятому серологическому (РСК) методу 15 животных, инфицированных возбудителем бруцеллеза. Способ изготовления вакцины из бруцелл осуществляется следующим образом. Пример 3. Питательной средой для выращивания бактериальной массы в целях приготовления профилактического препарата служит биофабричная Питательная среда для выделения и культивирования бруцелл сухая (эритрит-агар) с добавлением глюкозы, глицерина, дрожжевого экстракта и -цистина. Данную среду растворяют в дистиллированной воде, доводят до кипения, кипятят 2-3 мин до полного растворения агара, затем вливают глицерин и через 1 минуту засыпают глюкозу, дрожжевой экстракт и -цистина, доводят до кипения и фильтруют через ватно-марлевый фильтр,разливают в колбы Тартаковского и автоклавируют в течение 20 мин при температуре 121 С. После автоклавирования колбам придают горизонтальное положение до застывания агара. Для контроля стерильности их помещают на 48 часов в термостат при температуре 37 С. Выращенную и проверенную на чистоту матриксную культуру в объеме 5-10 см 3 100 млрд взвеси микробных тел с соблюдением условий стерильности засевают в колбы Тартаковского с твердым питательной средой. Культуру, засеянную в колбы, выращивают 48-72 часа в термостате при температуре 37 С,затем проводят смыв физиологическим раствором хлористого натрия и приготовление 2-х млрд микробной взвеси по КОЕ с последующей лиофилизацией, в бактериальную взвесь живых бруцелл конечной концентрации перед лиофилизацией добавляют ультразвуковой лизат-1 В-0268 в количественном соотношении лизата и полученной суспензии 12, затем бактериальную массу разводят физиологическим раствором до концентрации 2109 КОЕ/мл, лиофилизируют и используют по назначению в качестве целевого продукта. Пример 4. Установлено, что у полученного описанным способом препарата сохраняется способность индуцировать иммунное состояние организма животных, зараженных в течение первых 48 часов и далее. Срок годности готового препарата не менее 12 месяцев (срок наблюдения). Активность и специфичность полученной описанным способом вакцины была проверена в лабораторных и производственных условиях. Полученные при этом данные указывают на высокую активность и специфичность препарата, что позволяет быстро вызвать иммунное состояние и повышать напряженный иммунитет, дополнительно выявлять до 10 больных поголовья скота. Пример 5. При изучении профилактической активности вакцины 20-ти здоровым морским свинкам, вводили вакцину в дозе 0,1 см 3 внутрикожно средней трети брюшка по белой линии живота. Через 48 часов проводили заражение и контрольных животных. По истечению 30 сутки животные были убиты и подвергнута бактериологическому исследованию. При исследовании внутренних органов иммунизированных животных культура бруцелл не выделена, таким образом лабораторные животные приобрели иммунитет. В благополучной по бруцеллезу отаре овец ТОО Байсерке-Агро 30 здоровым овцам вводили внутрикожно опытную вакцину, а 30 овцам обычную вакцину. Указанные животные были подвергнуты заражению. По истечению 30 суток все животные были подвергнуты забою и их внутренние органы бактериологическому исследованию. При это установлено, что вакцинированные опытным препаратом животные оставались иммунными, а из числа вакцинированных обычной вакциной культура бруцелл заражающего штамма выделена у 27 животных или 90. Использование предложенного способа позволит при внутрикожным введение больным бруцеллезом животных вызвать местную воспалительную реакцию, а у здоровых - обеспечить индукцию иммунитета. Препарат может найти широкое применение в ветеринарной практике для диагностики бруцеллеза у крупного и мелкого рогатого скота. Таблица 1 Сравнительная специфичность бруцеллина Реагировало не испытуемый 10 2 10 3 10 2 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения аллерген-вакцины из бруцелл, включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл,автоклавирование и отделение дезинтеграта центфугированием, выращивание бруцелл на эритрит-агаре при температуре 37,5 С,смыв бактериальной массы физиологическим раствором поваренной соли и приготовление микробной взвеси с последующей лиофилизацией,отличающийся тем, что готовят взвеси бруцелл 50,0-100,0 млрд концентрации из штаммов-1 В-0268,19 В-0269 и 61 В-0270 на триссолянокислом буферно-физиологическом растворе с 9,0-10,0 и подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 в течение 15 минут с охлаждением водопроводной водой, затем вновь подвергают дезинтеграции ультразвуком 22 КГц и мощностью 100 Вт/см 2 15 минут без охлаждения,после чегодезинтеграта снижают до 5,0-6,0 с помощью 20 раствора трихлоруксусной кислоты и автоклавируют при температуре 120 С при 1,5 атм в течение 20-30 минут,затем дезинтеграт центрифугируют при 6000 об/мин в течение 40 минут, и доводятдо 7,0, стерилизуют автоклавированием при 1,0 атм в течение 30 мин и получают целевой продукт. 2. Способ получения аллерген-вакцины из бруцелл, отличающийся тем, что в бактериальную взвесь живых бруцелл в конечной концентрации перед лиофилизацией добавляют ультразвуковой лизат-1 В-0268 в количественном соотношении лизата и полученной суспензии 12, затем бактериальную массу разводят физиологическим раствором до концентрации 2109 КОЕ/мл, после чего лиофилизируют и используют в качестве целевого продукта.