Способ получения аллергена из бруцелл

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ИЗ БРУЦЕЛЛ(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения биологических препаратов, и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов, не обладающих сенсибилизирующими свойствами. Способ включает дезинтеграцию взвеси бруцелл-1 ультразвуком при рН 9,010,0, снижение рН дезинтеграта до 4,0-5,0 с помощью трихлоруксусной кислоты, автоклавирование при 1,0-1,5 ати в течение 20-30 мин и отделение дезинтеграта центрифугированием при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 мин. Затем доводят рН дезинтеграта до 7,0 и стерилизуют автоклавированием при 0,7- 1,0 ати в течение 30 мин или путем фильтрации. Предложенный способ позволяет получить бруцеллезный аллерген, не обладающий сенсибилизирующими свойствами, увеличить выход активного начала, упростить и сократить процесс получения целевого продукта.(72) Иванов Николай Петрович Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Бакиева Флюра Альбертовна Хусаинов Дамир Микдатович Амиргазиев Ералы Куанышбаевич(56) Предварительный патент РК 9609, 2000,бюлл. 11194264 А (Ковалев Л.В.), 07.06.1967316276 А (Одесский научно-исследовательский институт вирусологии и эпидемиологии им. И.И.Мечникова), 05.08.1979 Хорьков И.А. Дезинтеграция бруцелл ультразвуком при промышленном производстве диагностикумов. Тезисы докладов Всесоюзной конференции Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Москва, 1978, с. 174175. 14423 Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения биологических препаратов, и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов, не обладающих сенсибилизирующими свойствами. Известен способ получения бруцеллезных аллергенов, включающий лизирование вакцинных штаммов бруцелл, денатурацию термолабильных и пирогенных белков автоклавированием и удаление их центрифугированием (предварительный патент РК 9609, 2000). Недостатками этого способа являются относительно малый выход активных начал, длительность и сложность процесса приготовления. Предложенный способ получения аллергена из бруцелл включает дезинтеграцию взвеси бруцелл-1 ультразвуком при рН 9,010,0, снижение рН дезинте грата до 4,0- 5,0 с помощью трихлоруксусной кислоты, автоклавирование при 1,0-1,5 ати в течение 20-30 мин и отделение дезинтеграта центрифугированием при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 мин. Затем доводят рН дезинтеграта до 7,0 и стерилизуют автоклавированием при 0,7- 1,0 ати в течение 30 мин или путем фильтрации. Способ позволяет получить бруцеллезный аллерген, не обладающий сенсибилизирующими свойствами, увеличить выход активного начала, упростить и сократить процесс получения целевого продукта. Пример. Бруцеллы вида , например шт.-1, выращенные на эритритагаре, смывают с нее стерильным физиологическим раствором поваренной соли, дважды отмывают им же от остатков питательной среды. Затем доводят до концентрации 50 млрд. микробных тел (по бруцеллезному стандарту мутности) 0,05 М раствором трис-буфера (трис-буфер готовят следующим образом в мерной колбе на 1 литр вносят 6,057 г триса и доливают стерильной дистиллированной водой до метки рН -9,0-10,0). Полученную взвесь подвергают воздействию (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 22 кГц, мощности 100 Вт/см 2) ультразвуковых волн до просветления(10-15 минут). По окончании озвучивания в микробный дезинтеграт добавляют 20 -ный раствор трихлоруксусной кислоты до рН 4,0-5,0 и подвергают автоклавированию при 1-1,5 атм 20-30 минут. Выпавший после автоклавирования осадок отделяют центрифугированием, а надосадочную часть фильтруют через стерилизующий фильтр и используют в рабочем разведении (после предварительной титрации) в качестве аллергена. Установлено, что у полученных описанным способом препаратов сохраняется способность вызывать аллергическую реакцию организма животных,зараженных соответствующим возбудителем, при разведении аллергенов до 1100. Срок годности готового препарата не менее 18 месяцев. Активность и специфичность полученного описанным способом аллергена была проверена в лабораторных и производственных условиях. Полученные при этом данные указывают на высокую активность и специфичность препарата, что позволяет дополнительно выявлять до 10 больных животных. При изучении сенсибилизирующих и антигенных свойств ультразвукового аллергена 14 здоровым кроликам был введен препарат в рабочем разведении в дозе 0,1 см 3 внутрикожно в области средней трети брюшка. Далее указанным животным было проведено 7 кратное введение препарата с интервалом 7-10 дней. Параллельно после каждого введения брали кровь для серологических исследований. Учет аллергических и серологических реакций производили по общепринятым методикам. При этом во всех случаях был получен отрицательный результат. При исследовании сывороток крови с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами также получены отрицательные результаты. Кроме того, препарат вводили 12 морским свинкам в те же сроки, что и кроликам, по той же схеме и в той же дозе. После 7 введений аллергических реакций не возникло. Таким образом, ультразвуковой аллерген из бруцелл видапри внутрикожном введении в дозе 0,1 см 3 лабораторным животным (кролики,морские свинки) не проявляет сенсибилизирующих свойств. Эти же свойства изучали на благополучной по бруцеллезу отаре овец. При этом 120 здоровым овцам 4-кратно с интервалом 10-14 дней ввели ультразвуковой аллерген в рабочем разведении в дозе 0,5 см 3 под кожу нижнего века левого глаза (пальпебральная проба). Учет реакций произвели через 48 часов. Все животные реагировали отрицательно. Через 2,5 месяца после начала опыта у данных животных была взята кровь для серологических исследований с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами. Были получены отрицательные результаты. Следовательно, ультразвуковой аллерген из бруцелл видане проявляет сенсибилизирующих и антигенных свойств при 7-кратном введении кроликам и морским свинкам и при 4 кратном введении овцам в дозе 0,5 мл в пальпебральной пробе. Специфичность препарата проверяли в сравнении с контрольным коммерческим аллергеном в 2 опытах на искусственно сенсибилизированных бруцеллами вида овис овцах. Аллергены применяли в пальпебральной пробе в дозе 0,5 мл. Реакции учитывали через 48 часов. В таблице приведены результаты проверки специфичности препарата. 14423 Таблица Сравнительная специфичность бруцеллина Номер опыта Реагировало на испытуемый всего только на него 6 2 8 3 Как видно из данных таблицы, ультразвуковой аллерген из бруцелла вида овис проявляет более высокую специфическую активность, чем общепринятый (коммерческий) аллерген, изготовленный из бруцелл вида , применяемый для диагностики бруцеллеза овец. 12-14. Так же было проведено комплексное исследование на бруцеллез в двух неблагополучных по бруцеллезу отарах овец. Всего проведено комплексное (серологическое и аллергическое) исследование 163 овец разных возрастов на бруцеллез. При серологических исследованиях применялись официально утвержденные реакция агглютинации(РА) и реакция связывания комплемента (РСК) с коммерческими бруцеллезными антигенами. При аллергическом исследовании использовали аллерген из бруцелл вида , изготовленный путем дезинтеграции микробных клеток ультразвуком. В качестве контрольного аллергена был введен коммерческий бруцеллин. Оба аллергена вводили под кожу нижнего века левого (коммерческий бруцеллин) и правого (ультразвуковой бруцеллин) глаза в дозе 0,5 мл рабочего разведения (пальпебральная проба). В результате комплексного исследования выявлено с признаками бруцеллеза 20 животных, в том на коммерческий всего только на него 4 5 числе с аллергическими реакциями на коммерческий бруцеллин-18, на ультразвуковой бруцеллин-22. Следовательно, аллерген, изготовленный из бруцелл видас применением ультразвука, позволяет выявить в неблагополучных отарах дополнительно к общепринятому серологическому (РСК) методу 10 животных, инфицированных возбудителем бруцеллеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения аллергена из бруцелл, включающий дезинтеграцию взвеси бруцелл, автоклавирование и отделение дезинтеграта центрифугированием, отличающийся тем, что взвесь бруцелл-1 дезинтегрируют ультразвуком при рН 9,0 - 10,0, снижают рН дезинтеграта до 4,0 - 5,0 с помощью трихлоруксусной кислоты, автоклавируют при 1,0 - 1,5 атм в течение 20 - 30 мин,центрифугируют при 5-6 тыс. об/мин в течение 3040 мин, доводят рН до 7,0 и стерилизуют автоклавированием при 0,7 - 1,0 атм в течение 30 мин или путем фильтрации.