Способ получения суммарного полифенольного комплекса из корней кермека Гмелина

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Центральной Сибири и их лечебные свойства. Иркутск,Восточно-Сибирское книжное издательство, 1991, с.203.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУММАРНОГО ПОЛИФЕНОЛЬНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КОРНЕЙ КЕРМЕКА ГМЕЛИНА(57) Изобретение относится к органической химии,к способу получения биологически активной субстанции из растительного сырья. Разработан способ получения суммарного полифенольного комплекса из корней кермека Гмелина, включающий экстракцию растительного сырья (дважды) 50 водным спиртом при соотношении сырье-экстрагент, равном 16, и временем одноразовой экстракции, равном 5 часам. Объединенные отфильтрованные экстракты концентрируют в вакууме досуха при температуре 40-60 С с получением целевого продукта.(72) Жусупова Галия Евентаевна Абилов Жарылкасын Абдуахитович Рахимов Кайролла Дюсембаевич(73) Республиканское государственное предприятие Казахский национальный университет им. АльФараби Министерства образования и науки Республики Казахстан(56)7057 (Акционерное общество открытого типа Алматинская фармацевтическая фабрика),Кл.6 А 61 К 35/78, бюл.2, 15.02.19991819618 А 1 (Пятигорский фармацевтический институт), бюл.21, 07.06.19932063236 С 1(Государственный научный центр лекарственных средств), 10.07.1996 Телятьев В.В. Целебные клады. Растения, продукты животного и минерального происхождения 14418 Изобретение относится к органической химии, к способу получения биологически активной субстанции, которая может быть использована в медицине, сельском хозяйстве и других областях. Известен способ получения растительных дубящих веществ (Франция, заявка 2611140, кл. А 61 К 35/78, 1988), относящихся к полифенольным соединениям. Способ заключается в том, что траву лабазника вязолистного экстрагируют водно-органическими растворителями, например водным этиловым спиртом 80 , концентрируют до удаления спирта,полученный водный раствор наносят на колонку с полиамидом,например капрона,элюируют сопутствующие вещества водным спиртом (спиртвода 11), целевой продукт водно-щелочными растворами, например гидроксидом калия 2 н.,нейтрализуют разбавленными кислотами, например соляной 1 н., проводят диализ, полученный раствор концентрируют до небольшого объема, охлаждают до 4 С. Выпавший при стоянии осадок отделяют и высушивают. Выход целевого продукта 3,3-4,0 . Недостатком способа является необходимость использования водно-щелочных растворов,приводящих к быстрому окислению и деструкции дубильных веществ, что приводит к снижению их активности, а также многостадийность получения целевого продукта. Известен способ извлечения суммы полифенольных соединений, в частности дубильных веществ и флавоноидов, из смеси лекарственных растений - цветки календулы, ромашки и травы тысячелистника обыкновенного 3-кратной е экстракцией в 3-х перколяторах(при последовательном перекачивании экстракта из одного перколятора в другой) 40 водным раствором спирта в течение 48 часов (каждая) при соотношении сырье-эктрагент, равном 14,5-5,5 с последующим фильтрованием полученного экстракта (предпатент РК 7057, кл. А 61 К 35/78,1999). Недостатком способа является высокая продолжительность процесса экстракции,необходимость специального оборудования,невысокое содержание полифенольных соединений в сырье (около 9 ), а также технические трудности сбора сырья. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения суммарного полифенольного комплекса из растительного сырья с высоким выходом конечного продукта и позволяющего существенно сократить срок экстракции. Способ получения полифенольного комплекса из растительного сырья заключается в многократной экстракции его водным раствором этилового спирта при комнатной температуре. В качестве растительного сырья используют корни кермека Гмелина, а экстракцию проводят дважды 50 водным раствором этилового спирта при соотношении сырье-экстрагент, равном 16, и времени одноразовой экстракции, равном 5 часам, с последующим концентрированием 2 отфильтрованных и объединенных экстрактов при температуре 40-60 С. Предлагаемый способ позволяет в течение 10 часов получить целевой продукт с высоким выходом (около 30 ) и не требует специального оборудования. Суммарный полифенольный комплекс(именуемый далее субстанция) представляет собой кристаллическое вещество коричневого цвета с горьковато-вяжущим вкусом, со специфическим запахом, хорошо растворимое в воде и водных спиртовых растворах. Нерастворимо в липофильных растворителях бензоле, хлороформе, гексане,толуоле. Выделенную субстанцию анализировали проведением качественных реакций, а также 2 мерным хроматографированием в системах растворителей а) н-бутиловый спирт-уксусная кислота-вода в соотношении 4012,529 б) 2 водный раствор уксусной кислоты. Хроматографирование проводили в герметически закрытых камерах восходящим методом на бумаге марки 11. Высушенные хроматограммы проявляли,используя специфические проявители пары аммиака, 1 водный раствор хлористого алюминия, смесь 5 раствора нитрита натрия с 2 раствором уксусной кислоты, 1 водный раствор железоаммониевых квасцов,1(для обнаружения фенолокислот, флавоноидных и дубильных веществ) для обнаружения углеводов отолуидин и мочевину 1 спиртовый раствор нингидрина для обнаружения свободных аминокислот. Для идентификации амино-,фенолокислот и свободных сахаров использовали в качестве свидетелей достоверные образцы этих соединений. Качественная реакция на наличие дубильных веществ проводится 1 раствором железоаммониевых квасцов. Эта реакция идет с образованием комплекса от темно-синего до черного цвета, что свидетельствует о наличии орторасположенных фенольных гидроксильных групп в исследуемых соединениях. Существуют и другие реакции обнаружения дубильных веществ, а именно с диазотированным п-нитроанилином и ванилиновым альдегидом. Качественная реакция на флавоноиды проводится с 2 спиртовым раствором АС 3 с появлением желто-зеленого окрашивания. По данным хроматографического анализа качественных реакций, субстанция содержит смесь 22 веществ полифенольного характера. Они отнесены к фенолокислотам, флаванам, флавонам как в свободном виде, так и в виде гликозидов,дубильным веществам гидролизуемого и конденсированного типов. Кроме того,присутствуют аминокислоты,олигосахариды,витамин С. При химическом исследовании субстанции идентифицированы флавонолы(мирицетин,кверцетин, изорамнетин, монометиловый эфир мирицетина), их гликозиды (мирицитрин, рутин, 3 галактозилкверцетин и 3-галактозилмирицетин), 14418 фенол пирогаллол. Распределительной хроматографией на силикагеле, полиамиде и гельхроматографией на сефадексах получены фракции мономерных флаванов,дубильных веществ гидролизуемого и конденсированного ряда. Основным мономерным флаваном является (-)эпигаллокатехингаллат. Из гидролизуемых дубильных веществ выделены и идентифицированны 2-Огаллоил- и 2,3-Одигаллоил глюкоза. Моносахариды представлены глюкозой, рамнозой, дисахариды - рутинозой,олигосахариды состоят из остатков ксилозы и галактозы. Из фенолокислот идентифицированы галловая,сиреневая,изованилиновая. Количественный состав субстанции вотношении следующий влажность - 14,91 , зольность - 10,25, дубильные вещества - 50,12 , полисахариды - 2,6 , свободные аминокислоты - 2,2 ,аскорбиновая кислота - 0,14 . Влажность и зольность определены по ГФХ весовым методом. Количественное определение флавоноидов проведено методом спектрофотометрии на приборе СФ-46,калибровочную кривую строили по кверцетину. Количество дубильных веществ определено методом комплексонометрического титрования 0,01 М раствором динатриевой соли этилендиаминоуксусной кислоты (трилон Б). Количественное содержание свободных сахаров определено методом прямого спектрофотометрирования на бумаге, стандартом явилась глюкоза. Содержание аминокислот определено на аминокислотном анализаторе. Содержание полисахаридов определено методом спектрофотометрии после осаждения их из раствора 96 этиловым спиртом. Кермек Гмелина -семейства свинчатковыхдикорастущее многолетнее травянистое растение 30-80 см высотой. Встречается во всех районах Казахстана и имеет промышленные запасы за счет собственной возобновляемости. Учитывая крайнюю неприхотливость кермека, его способность расти на сильно засоленных почвах, а также замечательную способность регулировать содержание солей в почвах, введение его в культуру может быть достаточно легким и экологически благоприятным. Биологические особенности кермека Гмелина заключаются в легкости размножения его как семенами, так и вегетативным способом, а также быстром росте и высокой урожайности. В народной медицине отвар корней кермека Гмелина используется как вяжущее средство при детских летних поносах, при острых желудочнокишечных заболеваниях, для полоскания горла(Флора Казахстана. Алма-Ата Наука, 1961, т. ,с. 79-80 Воронина К.В. Материалы к изучению народных лекарственных растений Юго-Востока. Учен. зап. Сарат. ун-та, 1952, т. 35, с. 141-152), при венерических заболеваниях,маточных кровотечениях(Акопов И.Э. Кровоостанавливающие растения. Ташкент Медицина, 1977, с. 151). Оптимальные условия получения субстанции из корней кермека Гмелина определены экспериментально и подтверждены данными,приведенными в табл. 1-4. Наиболее приемлемыми растворителями,обеспечивающими выход максимального количества экстрактивных веществ из растительного сырья, являются спирт, ацетон и их водные растворы. При сравнительном исследовании спирта, ацетона и их водных растворов в различном соотношении, но в равных объемах, было показано,что наибольшее количество полифенолов наблюдается при соотношении вода-спирт 55. Именно при этом соотношении воды и спирта из сырья извлекается максимальное количество полифенольных соединений(табл. 1). Таблица 1 Влияние соотношения растворителей на полноту получения полифенольного комплекса при экстракции В соответствии с полученными данными в качестве подходящего и целесообразного растворителя был выбран водный раствор спирта в соотношении 55. Для определения оптимального объема растворителя при постоянных массе,времени и 2-кратной экстракции изменялся объем растворителя от 4-х до 12-кратного избытка (табл. 2). 3 14418 Таблица 2 Определение оптимального соотношения сырья и экстрагента Соотношение сырья растворителя 14 15 16 17 18 18 19 112 На основании полученных экспериментальных данных, представленных в табл. 2, оптимальное соотношение сырья и растворителя с максимальной экстракцией суммы полифенолов из сырья возможно при 6-кратном избытке растворителя. Было изучено время экстракции при постоянстве всех других параметров (масса, объем, число экстракций) (табл. 3). Время варьировалось от 4-х до 48 часов, причем каждый последующий опыт начинался через 1 час. Начиная с 4-х часов, шло увеличение дубильных веществ в субстанции, но эта величина возрастала незначительно и достигла 3,5 при 48-часовой экстракции. Таблица 3 Учитывая полученные данные, а также сменность на производстве, было выбрано 5-часовое время экстракции корней кермека Гмелина. Экстракция должна быть проведена дважды, так как именно 2-кратность, как свидетельствуют данные, приведенные в таблице 4, способствует максимальному извлечению полифенольного комплекса из сырья. В шроте, полученном после 2 кратного экстрагирования корней, резко снижается их количество до 6(табл. 4). Таблица 4 Влияние кратности экстракции на выход полифенолов Пример 1. 0,5 кг измельченных корней заливают 3,0 л 50 водного спирта и оставляют на 5 часов. Экстракт фильтруют, а сырье заливают вторично свежей порцией (3,0 л) водного спирта и вновь экстрагируют его в течение 5 часов. Отфильтрованные водно-спиртовые экстракты объединяют (5,1 л) и концентрируют при температуре 35-55 С в вакууме, досуха. Выход целевого продукта - 30,5 . 4 Пример 2. 0,5 кг измельченных корней заливают 3,0 л 50 водного спирта и оставляют на 5 часов. Экстракт фильтруют, а сырье заливают вторично свежей порцией (3,0 л) водного спирта и вновь экстрагируют его в течение 5 часов. Отфильтрованные водно-спиртовые экстракты объединяют (5,0 л) и концентрируют при температуре 45-65 С в вакууме досуха. Выход целевого продукта - 20,9 . 14418 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения суммарного полифенольного комплекса из растительного сырья путем экстракции водным раствором этилового спирта при комнатной температуре с последующим фильтрованием полученного экстракта,отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют корни кермека Гмелина, а экстракцию проводят дважды 50 водным раствором этилового спирта при соотношении сырьеэкстрагент, равном 16, и времени одноразовой экстракции, равном 5 часам,объединенные и отфильтрованные экстракты концентрируют в вакууме досуха при температуре 40-60 С.