Способ выявления возбудителя Pasteurella multocida методом ПЦР-РВ

(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к применению методов полимеразной цепной реакции(ПЦР) в реальном времени для выявления возбудителя, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях с целью эпизоотологического контроля и мониторинга болезни. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение бактериальной ДНК,синтез праймеров и зонда и постановку ПЦР-РВ на бактериальной генс детекцией в режиме реального времени с использованием синтезированных специфических праймеров и олигонуклеотидного зонда. Предложенный способ диагностики возбудителяметодом ПЦР-РВ является высокочувствительным и специфичным и позволяет достоверно определять наличие ДНК возбудителяв биологических пробах за 1,5 часа, без предварительного накопления тестируемого микроба и может быть использован для экспресс-идентификации.(72) Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна Богданова Марина Ивановна Строчков Виталий Михайлович Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Матвеева Валентина Михайловна Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Сейсенбаева Мадина Сагадатовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯМЕТОДОМ ПЦРРВ Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложен способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактериипри помощи ПЦР в реальном времени. Способ может быть использован в ветеринарной микробиологии для диагностики пастереллеза сельскохозяйственных животных.- условно-патогенная грамотрицательная бактерия, постоянно обитающая на слизистой оболочке верхних дыхательных путей животных. Бактерия обладает несколькими факторами вирулентности(капсула,дермонекротический токсин, адгезины, протектины,гиалуронидаза,железотранспортирующие протеины), обуславливающими ее патогенность для крупного рогатого скота ( / ,, //. - 2008. - .8 (2). .129-150). Комбинация факторов вирулентности у штаммов и изолятов бактерииможет быть разной,но во всех случаях обеспечивает проявление их патогенности. До настоящего времени основным способом диагностики .является выделения и идентифицирования культуры бактерий по биохимическим и культурально-морфологическим свойствам, а также постановки биологической пробы на чувствительных лабораторных животных. При этом культивирования,изучения биохимических свойств и наблюдение за зараженными животными проводят в течение 30 суток (Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц,утвержденные Главным управлением ветеринарии министерства сельского хозяйства Российской Федерации 22-7/82 от 20.08.1992 г.). К недостаткам данного способа относятся необходимость выделения и идентифицирования культуры бактерий по биохимическим и культурально-морфологическим свойствам, а также постановки биологической пробы на чувствительных лабораторных животных, что обуславливает его длительность, трудоемкость и дороговизну. Наиболее приемлемым, с точки зрения описанных недостатков и принятым за прототип,является способ, основанный на выявлении генаА, отвечающего за синтез дермонекротического токсина .в полимеразной цепной реакции, включающий выделение ДНК возбудителя из культур микроорганизмов,синтез специфических олигонуклеотидных праймеров 53 и 53,амплификацию ДНК возбудителя в гнездовой ПЦР, специфическую идентификацию продукта ПЦР размером 846 п.н. с помощью электрофореза в 2 агарозном геле К недостаткам данного способа можно отнести то, что он требует выделения ДНК из культуры бактерий, выявляет только штаммы и изоляты бактерии, продуцирующие дермонекротический токсин. Технической задачей предлагаемого решения является разработка нового эффективного способа выявления патогенных штаммов и изолятов бактериипри помощи синтетических олигонуклеотидных праймеров. Поставленная задача решается тем, что известный способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии,включающий получение и подготовку культурального материала и проведение ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, отличается тем,что ПЦР проводят непосредственно с бактериальной культурой,выделенной из патологического материала,используют олигонуклеотидные праймеры РМ 2, 2, зонд - РМ 19-- 1, ПЦР проводят в 1 раунд, диагностируют патогенные штаммы и изоляты бактерии. Сущность изобретения заключается в том, что разработан способ выявления возбудителя методом ПЦР-РВ,предназначенный для качественного выявления и исследованияданного заболевании. В качестве образцов для исследования могут быть использованы кровь, сыворотка, плазма крови,внутренние органы павших животных (печень,легкие, сердце, лимфатические узлы, почки,селезенка, кишечник), культуральные пробы. Задача изобретения Разработка способа экспресс-идентификации возбудителя, на основе ПЦРРВ. Способ диагностики возбудителявысокочувствительным и специфичным методом ПЦР-РВ позволяет точно и быстро (до 1,5 часа) выявлять ДНКв биологических пробах без предварительного накопления тестируемого микроба, что особенно важно при работе с патогенными штаммами. При этом возможно одновременное исследование большого количества проб. Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров и зонда,специфичных для. Для идентификации методом ПЦР-РВ в качестве мишени нами был выбран генА возбудителя. Отсутствие гомологии с другими микроорганизмами являлось основным критерием отбора олигонуклеотидов. Таким образом, для генабыла подобрана пара праймеров и зонд, которые являлись высоко консервативными и специфичными. Предложенный способ включает в себя реакцию ПЦР в режиме реального времени с праймерами, специфичными к участку гена. Матрицей для этой реакции служит ДНК возбудителя, а затравкой - праймеры РМ 2, состоящий из 19 звеньев 53 и РМ 2,состоящий из 20 звеньев 53, а также зонд-5-3-1. Реакцию анализируют по интенсивности роста кривых флуоресценции. Кривые реакции,которые пересекают пороговую линию до 40 цикла,считаются положительными и указывают на наличие в исходном материале ДНК возбудителя. Техническим результатом изобретения является повышение экономичности, сокращение времени проведения диагностической идентификации возбудителяс помощью ПЦРРВ. Изобретение может быть использовано для обнаружения возбудителя,основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов с возможной автоматизацией процесса. Способ выполняется следующим образом Выбор последовательности праймеров. Один из важнейших и ответственных этапов при разработке ПЦР является подбор и конструирование специфических праймеров. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации,что сказывается на качестве проведения анализа. Данный этап работы представлял собой аналитический процесс, который включал сбор имеющихся нуклеотидных последовательностей,как полных геномов, так и отдельных генов возбудителя из различных международных баз данных. Получить подробную информацию можно из международных компьютерных банков данных , через сеть Интернет. Были отобраны последовательности генов наиболее комплементарных между видами рода . После анализа нуклеотидных последовательностей возбудителя,следующим этапом исследований являлось подбор праймеров и зондов для постановки ПЦР в реальном времени. Нами были выбраны 5 генов.. 70 (004439) , , , , . Конструирование праймеров проводили с использованием программы 7. Режим Денатурация Денатурация Отжиг Элонгация В каждой серии анализов ставят два контрольных образца положительный контроль Полученные с помощью программы праймеры,проверяли на специфичность с использованием программы . По результатам проверки были выбран 1 набор праймеров на ген , которые показали наибольшую специфичность к-5-САСТТАААССА-3, а также зонд РМ 19- 5-СС-3-1. Синтез олигонуклеотидов. Моделированные последовательности праймеров и зонда были синтезированы в необходимом количестве на синтезаторе олигонуклеотидов 8909 (, США),согласно протоколам производителя и испытывались в экспериментах для постановки ПЦР-РВ и используются для постановки метода ПЦР-РВ. 3 .Выделение ДНК из образцов Выделение ДНК проводили с использованием наборав соответствии с наставлением по применению данного набора. 4. Проведение ПЦР-РВ с праймерами,специфичными к участкам генавозбудителя. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь наобразцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в следующей последовательности. Ферменты добавляют в последнюю очередь. 10 буфер ( 2 1,5 мМ)-2,0 мкл праймер РМ 2-0,5 мкл праймер РМ 2-0,5 мкл проба РМ 19-20 мкл. Смесь перемешивают и раскапывают в лунки капилляров, следя за тем, чтобы не допустить образование пузырьков воздуха в смеси. Затем в них вносят отдельным наконечником с фильтром по 2,0 мкл ДНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов (К и К-). Центрифугируют стрип, чтобы собрать со стенок все капли. Реакцию проводят в термоциклере 2.0 фирмы. Проводят ПЦР- РВ при следующих параметрах Таблица Время 2 мин 5 сек 5 сек 5 сек водой). Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемых образцов. 6. Детекция продуктов амплификации. 3 Учет результатов реакции проводят на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах уровень флуоресценции - цикл амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической матрицы, кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Программа определяет пороговый цикл реакции ( ),на котором достигается пороговая флуоресценция. При стандартных условиях проведения исследований и при условии равной эффективности реакции, значениепрямо пропорционально логарифму количества субстрата, что позволяет проводить сравнение количества субстрата. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения ДНК. Положительными считаются образцы, для которых значениеменее 40 циклов. Отрицательными считаются образцы, для которых значениеотсутствует. Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях- Отсутствие положительного сигнала в пробах с положительными контролями ПЦР-РВ может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках,допущенных на этапе постановки ПЦР-РВ. В таком случае необходимо провести ПЦР-РВ еще раз.- Если значениебольше 40, требуется повторить ПЦР-РВ и считать его вероятно положительным в случае повторения результата или получения значенияменее 40.- Появление любого значенияв таблице результатов для отрицательного контроля этапа выделения (на канале ) и для отрицательного контроля этапа ПЦР-РВ (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации. Фиг.1 и 2 демонстрируют конечный результат предлагаемого способа диагностики. Для определения специфичности ПЦРРВ метода использовали ДНК близкородственных возбудителей. 1-ДНК штамма //2011//(деионизированная вода) 6 - ДНК штамма Сайгачий возбудителя(питательный агар) 7 - штамм 544 В.(питательный агар) 8- штамм 21 . (питательный агар) 9- штамм(питательный бульон) 10 отрицательный контроль (деионизированная вода) 11 - ДНК штамма //2011// 12- штамм 1066 . (питательный агар) 13 штамм 21 . (органы мышат) 14 - штамм 21 . (органы мышат) 15 - отрицательный контроль (деионизированная вода). Фиг.1 - Определение специфичности метода ПЦР-РВ при обнаружении ДНК возбудителя. Для определения чувствительности метода по заявленному способу суточную культуру контрольного штамма,выращенную на кровяном агаре, переносят в бактериологическую пробирку, содержащую 1000 мкл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора,разводят до концентрации 1011 КОЕ/мл, титруют методом 10-кратных разведений до разведения 101 КОЕ/мл,каждое разведение подвергают исследованию в ПЦР. Чувствительность разработанной ПЦР составляет 103 КОЕ/мл. 1 - исходный материал ДНК возбудителя 102 2 - 101 3 - 102 4 - 103 5 104 6 - 105 7 - отрицательный контроль. Фиг.2 - Определение чувствительности метода ПЦР в реальном времени при обнаружении ДНК возбудителя(концентрацияв пробе, КОЕ/мл). Предложенный способ диагностики возбудителяметодом ПЦР- РВ является высокочувствительным и специфичным и позволяет достоверно определять наличие ДНК данного возбудителя в биологических пробах без предварительного накопления тестируемого микроба и может быть использован для экспрессидентификации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления патогенных штаммов и изолятов бактерии,включающий получение и подготовку культурального материала и проведение ПЦР-РВ с олигонуклеотидными праймерами, отличающийся тем, что ПЦР-РВ проводят непосредственно с бактериальной культурой,выделенной из патологического материала, используют следующие олигонуклеотидные праймеры и зонды 2 - ААААТС 2 -зонд-1, при этом выявление в анализируемых образцах кривых флуоресценции, которые пересекают пороговую линию до 40 цикла указывают на наличие в исходном материале ДНК возбудителя