Способ выявления антигена возбудителя pasteurella multocida методом ИФА

(51) 61 39/02 (2006.01) 61 39/102 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ клинических образцах с помощью иммуноферментного анализа. Предложен способ ИФА для обнаружения антигена возбудителя, где в качестве первого слоя сэндвича и в качестве улавливающих антител используются поликлональные антитела к штамму//2011// возбудителя. Изобретение предназначено для лабораторной диагностики возбудителя. Проводят сорбцию иммуноглобулина к штамму//2011// возбудителяна твердую фазу, отмывание избытка белка раствором, содержащим твин-80. Затем проводят взаимодействие иммуноглобулина с испытуемыми антигенами,а затем с иммунопероксидазным конъюгатом, добавляют субстрат и после инкубации регистрируют интенсивность окрашивания смеси. Разработанный способ постановки ИФА,основанный на использовании поликлональных антител к штамму //2011// возбудителя, пригоден для выявления антигена возбудителя в любых клинических образцах. Полученные данные положительно коррелировали с результатами ПЦР набора , Германия.(72) Сейсенбаева Мадина Сагадатовна Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Матвеева Валентина Михайловна Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Богданова Марина Ивановна Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯМЕТОДОМ ИФА(57) Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии ибиотехнологии, а именно к методам диагностики и идентификации бактериальных инфекций и представляет собой способ лабораторной диагностики антигена возбудителяв различных Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к методам диагностики и идентификации бактериальных инфекций и представляет собой способ выявления антигена возбудителяв различных клинических образцах с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Известен ряд способов диагностики возбудителя пастереллеза, например, микробиологический метод,реакция непрямой гемагглютинации и др. За последнее время наука достигла значительных результатов в области диагностики и эпизоотологического мониторинга инфекционных болезней животных. К одним из самых эффективных диагностических методов относится твердофазный иммуноферментный анализ , который к настоящему времени является одним из наиболее высокоспецифичных,чувствительных и достоверных методов количественной и качественной лабораторной диагностики болезней сельскохозяйственных и диких животных, птиц. С его помощью можно проводить массовое обследование поголовья, оценку иммунного статуса после профилактических мероприятий,выявить очаг инфекции и предотвратить ее распространение, подтвердить или исключить факт заболевания сложной этиологии, своевременно принять решение о необходимости вакцинации и терапии, осуществлять контроль затрат на проведение комплекса противоэпизоотических мероприятий. Преимуществами ИФА являются высокая чувствительность,позволяющая выявлять концентрации белка в диапазоне нг/мл и специфичность воспроизводимость полученных результатов стабильность при хранении всех необходимых реагентов простота проведения реакции возможность инструментального учета реакции и автоматизации всех ее этапов. Все они обусловили широкое применение данного метода, как в органах государственной ветеринарной службы. Известен набор для определения антител кв сыворотке крови кур методом иммуноферментного анализа производства(////// .). 16.06.2008. В состав набора входят иммуноспецифические и химические компоненты. Иммуноспецифические компоненты полистироловые 96-луночные планшеты,с адсорбированным в лунках очищенным инактивированным антигеномположительная сыворотка крови кур к(положительный контроль) нормальная сыворотка крови кур (отрицательный контроль), не содержащая антител кантивидовой иммунопероксидазный конъюгат противкур-химические компоненты буферный раствор для разведения контрольных и испытуемых сывороток и антивидового иммунопероксидазного конъюгата буферный раствор(концентрированный) для межэтапной промывки планшетов субстрат - раствор АБТС(концентрат) додецилсульфата натрия. Набор рассчитан на исследование 92, 184, 460 или 920 проб сыворотки крови кур в зависимости от комплектации. Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения исследований по мере поступления биологического материала при соблюдении условий их подготовки и хранения. Сущность непрямого варианта ИФА заключается в выявлении комплекса, образованного антигеном,сорбированным в лунках полистиролового планшета и специфическими антителами, содержащимися в пробах сывороток крови кур. Специфический комплекс выявляется антивидовыми,ковалентносвязанными с ферментом - пероксидазой хрена, который при взаимодействии с субстратом(Н 2 О 2) в составе бесцветной хромогенной смеси(АБТС) вызывает ее окрашивание. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Известна тест-система для выявления антител к(//./). Фирмаявляется мировым лидером в производстве диагностических наборов для ИФА в ветеринарии. При использовании тест-систем их производства специалисты имеют возможность получать, надежные и высокоточные результаты исследований при минимальной необходимости повторного тестирования. Производимые ЕХХ диагностические тестсистемы предназначены для- серологической диагностики заболеваний птиц- определения статуса стада (свободы от инфекции), мониторинга родительских стад определения уровня поствакцинального иммунитета и эффективности проведенной вакцинации птиц- выявления повышенных титров антител после воздействия полевых вирулентных штаммов возбудителей- определения уровня пассивного (материнского) иммунитета у цыплят, в том числе для выбора оптимального срока проведения вакцинации птиц против инфекционный болезней- для контроля родительских стад,- мониторинга инфекционных болезней птиц- контроля здоровья птиц при перевозке и поступлении на убой Отличительные характеристики ИФА технологии- тест-системына основе ИФА являются одними из самых чувствительных и достоверных. Они сертифицированы по международному стандарту 9001 2008 и являются признанным эталоном для ИФА во всем мире наряду с отличной чувствительностью тестсистемы обладают высочайшей специфичностью,исключающей перекрестные иммунные реакции отличительной особенностью диагностикумовявляется воспроизводимость технологии ИФА,позволяющая получать стабильно сопоставленные результаты при использовании тест-наборов разных серий на протяжении всего срока их годности- реагенты наборовготовы для использования и нуждаются только в доведении до комнатной температуры перед исследованием, что обеспечивает их точность, удобство в работе и сокращение времени на подготовку к тесту- использование компьютерной программыоблегчает анализ полученных данных и графический вывод результатов, а также их интерпретацию. Имеется набор РосАгроБиоПром для выявления антител к бактериямв сыворотках крови свиней иммуноферментным методом(///////.). В состав набора входят следующие компоненты- сыворотка крови свиней, положительная к .нормальная сыворотка крови свиней, не содержащая антител к бактериям .антиген .адсорбированный в лунках планшета для ИФА антивидовой иммунопероксидазный конъюгат противсвиней набор солей для приготовления буферного раствора набор солей для приготовления субстратного буфера детергент твин-20 - субстрат ортофенилендиамин перекись водорода,гидроперит. Сущность изобретения. Изобретение предназначено для лабораторной диагностики антигена возбудителя. Проводят сорбцию иммуноглобулина к антигенам штамма //2011/О/возбудителяна твердую фазу, отмывание избытка белка раствором, содержащим твин-80. Затем проводят инкубирование иммуноглобулина с испытуемыми антигенами, а затем с коньюгатом пероксидазы хрена, добавляют субстрат и после инкубации регистрируют интенсивность окрашивания смеси. Задача изобретения. Разработка эффективного варианта ИФА на основе иммуноглобулина к антигенам штамма//2011/О/возбудителяс целью обнаружения типоспецифического антигена данной бактерии в любых клинических образцах. Техническим результатом изобретения является разработка чувствительного и специфичного способа постановки ИФА, основанного на использовании поликлональных антител против штамма //2011/О/возбудителя, пригодного для выявления антигена данного заболевания в любых клинических образцах. Способ выполняется следующим образом. В лунки полистироловых плоскодонных плашек вносят специфический иммуноглобулин к антигенам штамма //2011// возбудителяв концентрации 30 мкг/см 3 в 0,01 М КББ, с рН 9,6. Планшет выдерживают в течении 3 ч при (370,5)С или 18 ч при (42)С. Затем планшет трижды промывают раствором для ИФА и вносят в качестве наполнителя 1 раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в каждую лунку и инкубируют при (370,5)С в термостате в течение 1 ч. Затем содержимое лунок удаляют, плашку однократно промывают раствором для ИФА (ФБСТ). Готовят разведения контрольных и испытуемых проб антигенов (как указано на схеме) в растворе для ИФА и разливают по 0,13 см в один ряд лунок плашки (по горизонтали). Схема постановки ИФА по выявлению антигена возбудителяАнтиген Примечания 1. , - - отрицательный результат (слабо-голубое окрашивание или окрашивания нет). 2.- положительный результат (синее окрашивание). Раствор для ИФА,контроль Пластину с нанесенными на нее пробами инкубируют в течении 3 ч при (370,5)С или 16 ч при (42)С. Затем пятикратно промывают раствором ФБСТ. После промывки и просушивания планшета в каждую лунку вносят по 0,1 см 3 рабочего разведения пероксидазного конъюгата в растворе ФБСТ. Плашку с конъюгатом инкубируют в термостате при (371)С в течении 1 ч, пятикратно промывают вышеупомянутым раствором для ТФИФА и вносят по 0,13 см рабочего раствора субстрата для пероксидазы (АБТС). Результаты реакции учитывают через 30-60 мин. Учет результатов ИФА проводят визуально или на фотометре марки Мультискан. При визуальном 3 учете реакции титром антигена считают его предельное разведение, в котором он связывается со специфическим иммуноглобулином,иммобилизированным на твердой фазе (в лунках пластин) и вызывает окисление субстрата(развивается синее окрашивание). При этом интенсивность окрашивания должна уменьшаться с разведением антигена. В лунках, обработанных отрицательным антигеном(контроль специфичности),допускается слабо-голубое окрашивание,исчезающее до разведения диагностикума 110. При учете результатов реакции на фотометре марки Мультискан при длине волны 405 нм, для АБТС, результаты считают положительными, если оптическая плотность специфического антигена в 2 и более, раз превышает оптическую плотность контрольного(нормального) антигена. Разработанный способ постановки ИФА,основанный на использовании поликлональных антител против штамма, пригоден для выявления антигена данного заболевания в любых клинических образцах. Полученные данные положительно коррелировали с результатами ПЦР набора ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ выявления антигена возбудителяметодом иммуноферментного анализа, включающий выявление антигена бактерийв клинических образцах в течении 5 или 24 часа после поступления биоматериала, отличающийся тем, что используют при разработке ИФА поликлонального иммуноглобулина, к нововыделенному от сайгаков,штамму //2011// возбудителя, в концентрации 30 мкг/см и иммунопероксидазного конъюгата приготовленного на основе того же иммуноглобулина по методуи .