Способ получения антигена возбудителя Pasteurella multocida

(51) 61 39/02 (2006.01) 61 39/102 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Проведен метод концентрирования штамма//2011// возбудителяна питательном агаре (условия культивирования 24 ч при 37 С) приготовлена достаточная биомасса для приготовления антигена. Способ получения очищенного и концентрированного антигена возбудителя- микробные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывали физиологическим раствором 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляли небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушали путем замораживания при минус 60 и оттаивания при 37 С от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин., и полученные надосадочные жидкости использовали в качестве антигена в тест- системах. Приготовленный антиген обладает высокой специфичностью и позволяет выявлять антитела к возбудителюв пробах сывороток крови.(72) Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Матвеева Валентина Михайловна Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Сейсенбаева Мадина Сагадатовна Корягина Марина Ивановна Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВОЗБУДИТЕЛЯ(57) Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к методам диагностики бактериальных инфекций и представляет собой способ получения антигена к возбудителюдля лабораторной диагностики возбудителя. Полученный антигенявляется специфичным и активным, а также пригоден для постановки лабораторных тест-систем и для проведения серологического мониторинга возбудителя. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к методам диагностики бактериальных инфекций и представляет собой способ получения антигена к возбудителю. Известен способ изготовления эмульсионной противопастереллезной вакцины, включающий,производственные штаммысеротипов А, Д и В культивируют в питательной среде, содержащей бульон по Хоттингеру с добавлением 10-15 сыворотки КРС,7,6-7,8 и показателем аминного азота 200-250 мг. Полученную бактериальную массу подвергают инактивации аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ). АЭЭИ вносят в бактерийную суспензию до концентрации 0,5-4. Смесь инкубируют в течение 12-16 ч при 37-38 С. По окончании инактивации полученный антиген вносят в сахарозожелатиновую среду. После этого антиген соединяют с масляным адъювантом в соотношении 37 соответственно. Изобретение повышает иммуногенную активность и специфическую безопасность вакцины. (Способ изготовления эмульсионной противопастереллезной вакцины,Россия, патент 2162339, МПК А 61 39/102, 61 2/16,12 1/00,Всероссийский научноисследовательский институт защиты животных,Гусев А.А. Русалеев Сосницкий А.И. Гневашев В.М. Прунтова О.В. заяв. 2000109667/13 от 17.04.2000, публ. 27.01.2001). Известен способ изготовления антигена для других бактериальных инфекций, включающий,получение посевного материала и производственное культивирование штамма 19 в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, , дрожжевой аутолизат и воду. Культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19 - 21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования. После внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20-25 р 2,с 6 по 16-18 ч культивирования - 40 - 45 р 2 и затем с 16-18 по 19-21 ч - 30-35 р 2. Выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15 - 50 кД. Инактивируют нагреванием. Окрашивают роз-бенгалом, ресуспендируют в буферном разбавителе и стандартизируют целевой продукт. Изобретение позволяет упростить технологию и значительно сократить время получения бруцеллезного цветного антигена для РБР, а также повысить качество (способ изготовления бруцеллезного антигена для Роз Бенгал пробы (РБП), номер патента 2163141 класс(ы) патента А 61 39/10, 01 33/569, 12 1/20 номер заявки 2000119188/13, Дата подачи заявки 20.07.2000, дата публикации 20.02.2001). Недостатком полученных данными способами антигенов является то, что авторами данных работ не использовался метод очистки антигенов, так как во многом специфичность приготовленных 2 препаратов для постановки тест-систем при диагностике зависит от чистоты препаратов. Нами проведенный поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, не были обнаружены источники,характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Предложенный способ обладает следующими преимуществами позволяет получить в короткое время активный и специфичный антиген возбудителя, для постановки диагностических тест-систем. Изобретение предназначено для лабораторной диагностики возбудителя. Приготовленный антиген возбудителя применяется для проведения серологического мониторинга возбудителяв тест-системах. Проведен метод концентрирования и очистки штамма//2011// возбудителяна питательном агаре (условия культивирования 24 ч при 37 С) приготовлена достаточная биомасса для приготовления антигена. Способ получения очищенного и концентрированного антигена возбудителя- микробные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывали физиологическим раствором с 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляли небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушали путем замораживания при минус 60 и оттаивания при 37 С от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин., и полученную надосадочную жидкость использовали в качестве антигена в тест- системах. Задача изобретения. Разработка способа получения активного и специфического антигена возбудителя, пригодного для проведения серологического мониторинга в сыворотках крови методами реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментного анализа(ИФА). Полученный специфический антиген используется для постановки тест-систем на выявление антител против возбудителяв пробах сыворотки крови. Техническим результатом изобретения является способ получения специфичного и активного антигена возбудителядля проведения серомониторинга на болезнь в лабораторных тест-системах. Активность приготовленного данным способам специфического антигена возбудителясоставляет в РДП - 1/32, в ИФА 1/6400. Способ выполняется следующим образом. Получение биомассы на питательном агаре, срок культивирования 24 часа при 37 С. Приготовление суспензии на физиологическом растворе, объем 50 см 3 на одну чашку Петри. Инактивация суспензии формалином в конечной концентрации 0,3 в течение 24 часов. Проверка остаточной вирулентности изолята Сайгачий и штамма//2011// возбудителя пастереллеза на питательном агаре и белых мышатах. Освобождение от клеточных балластов путем центрифугирования при 1000 об/мин 15 мин. Десятикратная концентрация суспензий путем центрифугирования при 10000 об/мин 15 мин. В процессе культивирования штамма//2011// возбудителяна питательном агаре (условия культивирования 24 ч при 37 С) приготовлена достаточная биомасса для приготовления антигена. Способ получения очищенного и концентрированного антигена возбудителя- микробные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывали физиологическим раствором 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляли небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушали путем замораживания при минус 60 и оттаивания при 37 С от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин., и полученную надосадочную жидкость использовали в качестве антигена в тест- системах. Активность приготовленного данным способом специфического антигена возбудителясоставляет в РДП - 1/32, в ИФА 1/6400. Приготовленный антиген обладает высокой специфичностью и позволяет выявлять антитела к возбудителюв пробах сывороток крови. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена возбудителя, включающий наработку активной биомассы на питательном агаре, очистку и концентрирование антигена, с применением центрифугирования и отмывки физиологическим раствором,с последующим многократным термолизисом, отличающийся тем, что применяют антиген к штамму //2011// возбудителя, выделенный от сайгаков и также проводят глубокое замораживание при минус 60 С и оттаивание при 37 С от 12 до 14 раз для разрушения микробных клеток.