Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и ветеринарной микробиологии и касается способов приготовления диагностических антисывороток.
В качестве антигена для гипериммунизации овец, используют штамм «Pasteurella/Saigas/201 l/ZKO/KZ», выделенный из очага эпизоотии, от павшего сайгака в Западно-Казахстанской области в 2011 году.
Цель изобретения - разработка способа приготовления высокоактивных специфических антител к возбудителю Pasteurella multocida, пригодных для диагностики в различных образцах биологических материалов методами РДП и ИФА.
Способ предусматривает концентрирование антигена, для этого микробные клетки осаждают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывают физиологическим раствором рН 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляют небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушают путем замораживания (-60°) и оттаивания (37°С) от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена возбудителя Pasteurella multocida, определяют концентрацию белка в препарате, определяют активность и специфичность полученного концентрата в серологических тестах, иммунизируют животного-донора путём двукратного введения в область предлопаточных лимфоузлов очищенного антигена в возрастающих дозах (120-500 мкг) на животное, в присутствии 0,1% ГОА и Montanide ISA-70, для повышения иммуногенеза, забор крови животного через 7 суток, получение гипериммунной специфической антисыворотки.
Техническим результатом способа является получение специфических антител к возбудителю Pasteurella multocida, пригодных для постановки тест-систем, таких как РДП и ИФА. Приготовленные антитела используют для составления диагностических наборов, применяемых в целях диагностики возбудителя Pasteurella multocida в различных образцах биологических материалов.

Текст

Смотреть все

(51) 61 39/02 (2006.01) 61 39/102 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ предусматривает концентрирование антигена, для этого микробные клетки осаждают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывают физиологическим раствором 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляют небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушают путем замораживания (-60) и оттаивания (37 С) от 12 до 14 раз. После последнего оттаивания взвесь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена возбудителя, определяют концентрацию белка в препарате, определяют активность и специфичность полученного концентрата в серологических тестах, иммунизируют животногодонора путм двукратного введения в область предлопаточных лимфоузлов очищенного антигена в возрастающих дозах (120-500 мкг) на животное, в присутствии 0,1 ГОА и-70, для повышения иммуногенеза, забор крови животного через 7 суток, получение гипериммунной специфической антисыворотки. Техническим результатом способа является получение специфических антител к возбудителю, пригодных для постановки тест-систем,таких как РДП и ИФА. Приготовленные антитела используют для составления диагностических наборов,применяемых в целях диагностики возбудителяв различных образцах биологических материалов.(72) Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Нурабаев Сергазы Шуратбаевич Матвеева Валентина Михайловна Сансызбай Абылай Рысбайулы Сандыбаев Нурлан Тамамбаевич Сейсенбаева Мадина Сагадатовна Корягина Марина Ивановна Сугирбаева Гульнур Джолдасбековна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К ВОЗБУДИТЕЛЮ(57) Изобретение относится к биотехнологии,иммунологии и ветеринарной микробиологии и касается способов приготовления диагностических антисывороток. В качестве антигена для гипериммунизации овец,используют штамм//2011//, выделенный из очага эпизоотии, от павшего сайгака в ЗападноКазахстанской области в 2011 году. Цель изобретения - разработка способа приготовления высокоактивных специфических антител к возбудителю,пригодных для диагностики в различных образцах биологических материалов методами РДП и ИФА. Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и ветеринарной микробиологии и касается способов приготовления диагностических антисывороток. Известен способ получения диагностической сыворотки к возбудителю,включающий грундиммунизацию и гипериммунизацию, причем грундиммунизацию двукратно с интервалом 21 день,а гипериммунизацию осуществляют 8-10 внутримышечнными инъекциями с интервалом 2- 3 дня пастереллезным антигеном при общей дозе 6451000 млрд. микробных тел, (способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза,стрептококкоза и пастереллеза свиней, патент 2007123692, номер заявки 20070123692 20070626, номера приоритетных документов 20070123692 20070626, 2009-01-10). Также известен способ получения диагностической сыворотки,включающий многократную иммунизацию животных-продуцентов авирулентным антигенным материалом в совокупности с иммуномодуляторами, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве иммуномодуляторов используют тималин и циклофосфан, иммунизацию осуществляют пятикратно,антигенный материал вводят внутривенно,иммуномодулятор тималин внутримышечно одновременно с инъекцией антигена, при этом циклофосфан вводят однократно с третьей инъекцией(Способ получения диагностической сыворотки,Россия,патент 97114296, МПК А 61 39/40, С 07 16/12, А 61 39/39, Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт,Тюменцева И.С.,Афанасьев Е.Н., Ефременко В.И., Базиков И.А.,Алиева Е.В. заяв. 97114296/13 от 1997.08.19, публ. 1999.07.10). Также известен способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней, включающий приготовление антигена из инактивированных и концентрированных культурсероваров А, В и Д исероваров 1 и П, грундиммунизацию и гипериммунизацию возрастающими дозами антигена с последующим крововзятием и выделением целевого продукта, отличающийся тем,что в качестве продуцентов используют волов, при этом гипериммунизацию проводят 7-10-кратными внутримышечными инъекциями в общей дозе каждого антигена 1800-2400 миллиардов микробных клеток с интервалом 2-3 дня, а грундиммунизацию осуществляют подкожно в разные участки тела двукратно сначала по 10-15 миллиардов микробных клеток, а через 14 дней по 20-25 миллиардов микробных клеток с добавлением 10 см 3 гидроокиси алюминия (Способ получения гипериммунной сыворотки против гемофилеза и пастереллеза свиней. Россия. Патент 2118169. МПК А 61 39/40, А 61 39/02, А 61 39/102, А 61 39/395. Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической 2 промышленности, Школьников Е.Э. Коломнина Г.Ф. Белоусов В.И. Лукьянова Е.М. Сидоров М.А. Скородумов Д.И. Панин А.Н. Малик Е.В. Гараев И.М. Шегидевич Э.А. Федотов В.Б. Ставцева Л.Я. заяв. 96117716/13 от 02.09.1996, публ. 27.08.1998). Недостатком, полученных данных способами сывороток,является длительность метода,получение антисыворотки занимает три месяца,также антисыворотка предназначена для создания пассивного иммунитета животных. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников,содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники,характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Изобретение предназначено для приготовления высокоактивных специфичных антисывороток к возбудителю. Животныхпродуцентов (овец) однократно иммунизируют, на 21 сут проводят гипериммунизацию очищенным препаратом возбудителяв возрастающих дозах внутримышечно в область предлопаточных лимфоузлов с интервалом между введениями 7 сут. Первое введение проводят в комплексе с адъювантом ГОА в конечной концентрации 0,1, второе введение с адъювантом 70 в соотношении 10,5. Сыворотки получают на 7 день после последней иммунизации. Техническим результатом изобретения является разработка способа получения высокоактивной и стабильной при хранении антисыворотки к возбудителю. Задача изобретения. Разработка способа получения высокоактивной специфической антисыворотки к возбудителю,пригодной для диагностики заболевания в различных образцах биологических материалов методами реакции диффузионной преципитации(РДП) и различных вариантов ИФА. Активность приготовленных данным способом специфических антител к возбудителюсоставляет в РДП - 1/32, в ИФА 1/6400. Антиген возбудителя,используемый для гипериммунизации животных,получен из штамма//2011//, выделенного от павшего сайгака из очага эпизоотии, в ЗападноКазахстанской области в 2011 году. Способ выполняется следующим образом. 1. Наработки активного антигена возбудителя. Технологическая схема получения очищенного антигена штамма //2011// возбудителя пастереллеза- Получение биомассы на питательном агаре,срок культивирования 24 часа при 37 С.- Приготовление суспензии на физиологическом растворе, объем 50 см 3 на одну чашку Петри. последнего оттаивания взвесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость использовали в качестве антигена возбудителя. 3. Схема получения антисыворотки к возбудителюАнтисыворотку к возбудителюполучают на овцах местной породы. Первоначально овец иммунизировали очищенным и концентрированным антигеном штамма//2011// возбудителя пастереллеза в область предлопаточных лимфатических узлов, подкожно по 1,0 см 3. По истечении 18 сут овец подвергали 1 -кратной гипериммунизации путем введения в область предлопаточных лимфатических узлов антигена в объеме 2,0 см 3 с адъювантом - ГОА в конечной концентрации 0,1. Через 7 сут после первого введения, проводили второе введение антигена в область предлопаточных лимфатических узлов в объеме 5 см 3 с адъювантом-70 - в соотношении 10,5. Оценку активности и специфичности,полученных антисывороток,проводят в РДП и ИФА. Результаты представлены в таблице Таблица Разработанная схема получения антисыворотки к- Инактивация суспензии формалином в конечной концентрации 0,3 в течение 24 часов.- Проверка остаточной вирулентности штамма//2011// возбудителя пастереллеза на питательном агаре и белых мышатах.- Освобождение от клеточных балластов путем центрифугирования при 1000 об/мин 15 мин.- Десятикратная концентрация суспензии путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 мин. Определение активности антигена производят в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле по общепринятой методике. 2. Приготовление очищенного концентрата Для приготовления очищенного антигена,сначала микробные клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и трижды отмывали физиологическим раствором 7,0-7,2. Осадок микробных клеток разбавляли небольшим объемом дистиллированной воды до получения взвеси 50 млрд. в 1 мл (по оптическому стандарту мутности). Микробные клетки разрушали путем замораживания при минус 60 и оттаивания при 37 С от 12 до 14 раз. После Объем вводимого материала (см 3) на 1 голову Концентрация белка в мкг 1,0 2,0 с адъювантом - ГОА в конечной концентрации 0,1 5,0 с адъювантом 70 - в соотношении 10,5 Через 7 суток, после последнего введения материала,овец тотально и стерильно обескровливают. Сыворотку отстаивают в термостате при 37 С. Отстоявшуюся сыворотку осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 30 минут и исследуют в тест-системах (РДП и ИФА). Полученную по данному способу сыворотку используют в РДП и для приготовления антительных диагностикумов для метода ИФА и применяют для лабораторной диагностики возбудителяв различных клинических материалах. Приготовленная сыворотка обладает высокой специфичностью и позволяет выявлять антиген возбудителяв любых клинических материалах при отрицательных результатах в пробах гетерологичных антигенов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антисыворотки к возбудителю, включающий наработку активного антигена возбудителя на питательном агаре, приготовление очищенного концентрата, грундиммунизацию и двукратную гипериммунизацию овец очищенным и концентрированным антигеном возбудителя, в возрастающей дозе, с интервалом между введениями в 7 суток, причем для повышения иммуногенеза при первом введении используют смесь антигена с ГОА, втором введении с-70, обескровливание животного по истечении 7 суток после последней инъекции и отделение сыворотки, отличающийся тем, что используют штамм

МПК / Метки

МПК: A61K 39/02, A61K 39/102

Метки: multocida, антисыворотки, способ, получения, возбудителю, pasteurella

Код ссылки

<a href="https://kz.patents.su/3-ip27005-sposob-polucheniya-antisyvorotki-k-vozbuditelyu-pasteurella-multocida.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ получения антисыворотки к возбудителю Pasteurella multocida</a>

Похожие патенты