Инактивированная ассоциированная вакцина против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей

(51) 61 39/116 (2006.01) 61 31/10 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ одновременно предохраняющей лошадей от мыта,пастереллеза и сальмонеллеза. Инактивированная ассоциированная вакцина против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей, включающая антигены из штаммов,, гидрат окиси алюминия, формалин и физиологический раствор, в качестве антигенов используют штаммыВ-0240,В 0242 и дополнительно антиген В-0199,а в качестве консерванта дополнительно азид натрия при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штаммаВ-0240 20,0-25,0(20109 КОЕ/см 3) 20,0-25,0 гель гидрата окиси алюминия(72) Каратаев Болат Шайзадаевич Намет Айдар Мырзахметулы Жусупов Галымжан Кайырбекович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ИНАКТИВИРОВАННАЯ АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ МЫТА,ПАСТЕРЕЛЛЕЗА И САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ЛОШАДЕЙ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности,к способам получения ассоциированных вакцин и может найти широкое применение в ветеринарной практике для специфической профилактики мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной инактивированной ассоциированной вакцины, 29237 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к способам получения ассоциированных вакцин и может найти широкое применение в ветеринарной практике для специфической профилактики мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей. Известна инактивированная ассоциированная вакцина против мыта и пастереллеза лошадей,включающая антигены из штаммов,, гидрат окиси алюминия,формалин и физиологический раствор Каратаев Б.Ш., Сансызбай А.Р., Бижанов А.Б.,Намет А.М.,Керимбаев У.Н. НТД Ассоциированная вакцина СП против мыта и пастереллеза лошадей (Инструкция, Наставление,СТ). -Утв. Комитетом государственной инспекции в агропромышленном комплексе МСХ РК от 05.06.2007. - Астана, 2007. с.35. Недостатком известного способа является предохранение животных только от мыта и пастереллеза, а также недостаточная эффективность,обусловленная низкой иммуногенностью и высокой реактогенностью вакцины. Задачей изобретения является создание способа получения высокоиммуногенной ассоциированной вакцины против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной инактивированной ассоциированной вакцины,одновременно предохраняющей лошадей от мыта,пастереллеза и сальмонеллеза. Инактивированная ассоциированная вакцина против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей, включающая антигены из штаммов,, гидрат окиси алюминия, формалин и физиологический раствор, в качестве антигенов используют штаммыВ-0240,В 0242 и дополнительно антиген В-0199,а в качестве консерванта дополнительно азид натрия при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штаммаВ-0240(20109 КОЕ/см 3) 20,0-25,0 гель гидрата окиси алюминия(0,001) 0,001-0,002 физиологический раствор остальное. Штаммы бактерий,используемые для изготовления инактивированной ассоциированной вакцины против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей, депонированы в лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО КазНИВИ и обладают следующими свойствами. 2 Штамм бактерийВ-0240 Культуральные свойства. На МПА с добавлением 10 сыворотки крови и 1 глюкозы образует мелкие, округлой формы, росинчатые, прозрачные,гладкие, вязкой консистенции, сливающиеся колонии трудно снимаемые петлей. При просмотре на свет прозрачные с голубоватым оттенком, при хранении в течение 2-4 сут колонии становятся серовато-белыми, прозрачными, но сохраняют гладкие очертания. На МПБ с добавлением 10 сыворотки крови и 1 глюкозы присреды 7,4 дает рост в виде помутнения среды с образованием небольшого осадка на дне пробирки, при хранении в течение 3-5 сут бульон просветляется с образованием обильного сероватого осадка. Биохимические свойства. Обладает слабовыраженными биохимическими свойствами,не растет в МПБ с 40 желчи, не изменяет молоко с метиленовой синью, не свертывает молоко, не редуцирует лакмус, не ферментирует сорбит,маннит, глицерин, арабинозу, рафинозу, лактозу, не разжижает желатину, а разлагает глюкозу, сахарозу и мальтозу с образованием кислоты без газа. Маркерные признаки. Лизирует эритроциты лошади, белых мышей, слабо лизирует эритроциты кроликов, не лизирует эритроциты золотистых хомячков, не ферментирует лактозу и манит, не продуцирует стрептолизин О,продуцирует гемолизин, лейкоцидин, токсин общего действия и агрессин. Антигенные свойства. Штамм преципитируется специфической стрептококковой сывороткой серологической группы С. Антигенная активность. При парентеральном введении в организм лошади вызывает выработку антител, выявляемых в РНГА, титр 13200. Принадлежность к трофической группе. Прототроф. Генетические особенности штамма. Лизирует эритроциты лошади, белых мышей, слабо лизирует эритроциты кроликов, не лизирует эритроциты золотистых хомячков, не ферментирует лактозу и манит,не продуцирует стрептолизин-О,продуцирует гемолизин, лейкоцидин, токсин общего действия и агрессин. Продукт, синтезируемый штаммом - гемолитический токсин. Активность(продуктивность). Лизис эритроцитов лошади и белой мыши. Реактогенность. Обладает умеренно-средней степенью реактогенности для лошадей. Иммуногенность. При внутримышечном введении в дозе 3106 КОЕ продолжительность напряжения иммунитета у белых мышей составляет 12 мес. Стабильность при пассировании. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются в течение 12 мес (срок наблюдения). Штамм хранится в темном месте, в лиофильно высушенном состоянии и в стеклянных ампулах под вакуумом при температуре от 4 до 10 С в течение 12 мес. Штамм бактерийВ-0242 Культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на МПА или агаре Хоттингера при температуре 37 С, оптимальное- 7,2-7,4, в течение 24-48 часов. Грамотрицательные бактерий короткие овоидные палочки, размеры клеток 0,5-2,5 мкм, неподвижны,очертания концов закругленные, клеточные стенки содержат липополисахарид, консистенция -формы. Биохимические свойства. Источники углерода ферментирует маннит,сахарозу,глюкозу,мальтозу,дульцит,не ферментирует арабинозу, галактозу, лактозу,раффинозу. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты каталаза, оксидаза,лизиндекарбоксилаза, образует индол, сероводород,редуцирует нитраты в нитриты, не свертывает молоко, не разжижает желатин. Маркерные признаки штамма. Гемолизирует эритроциты морской свинки и не гемолизирует эритроциты барана. Принадлежность к трофической группе. Хемогетеротроф. Типы катаболизма. Аэроб или факультативный анаэроб. Симбиотрофные отношения. Паразитизм. Назначение штамма бактерий. Продуцирует гемолитический токсин, гемолизирует эритроциты морской свинки и не лизирует эритроциты барана. Используется для профилактики пастереллеза лошадей. Состав среды и условия культивирования. МПА или агар Хоттингера с добавлением 5 эритроцитов барана или 5-10 сыворотки крови лошади. Способ, условия и состав сред для хранения. Лиофильно высушенный или на косячках с 1,5 МПА или агаром Хоттингера при температуре 222 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма. МПА или агар Хоттингера с добавлением 5 эритроцитов барана или 5-10 сыворотки крови лошади. Штамм бактерийВ-0199 Культуральные свойства. МПБ, МПА, висмутсульфитный агар, среда Эндо 37, 24 часа в термостате. Грамотрицательные палочки округлой формы, длиной 1-3 мкм, шириной 0,5 - 0,8 мкм. Подвижные с перитрихиальными жгутиками,размножается путем деления. На плотных питательных средах образуют гладкие, блестящие,куполообразные, с ровными краями колонии. В МПА колонии прозрачные, нежные, голубоватые. На висмут-сульфитном агаре колонии черные. На среде Эндо колонии слегка розового цвета,прозрачные. На жидких питательных средах образует равномерное помутнение среды. Биохимические свойства. Каталазаположительный,оксидазаотрицательный, урезаотрицательный. Не разжижает желатин. Разлагает цитрат натрия, реакция с метилрот положительная, Фогес- Проскауэра отрицательная. Не ферментирует лактозу, сахарозу, не образует сероводород и индол. Маркерные признаки. Типируется поливалентной А, В, С, , Е и монорецепторными сальмонеллезными О-4, 12 и Н-сыворотками. Антигенная активность. Титр сыворотки в РА 11600 Принадлежность к трофической группе. Прототроф. Генетические особенности штамма. Возможна диссоциация в - форму вследствие генетических мутаций. Патогенность. Патогенен для белых мышей и жеребых кобыл. Обладает абортогенными свойствами, вызывает аборты у жеребых кобыл. Вызывает гибель белых мышей в дозе 5 млн. микробных клеток при внутрибрюшинном введении. Способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Инактивированную ассоциированную вакцину против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей используют внутримышечно однократно при следующих соотношениях компонентов антиген из штаммаВ-0240(20109 КОЕ/см 3) 20,0 гель гидрата окиси алюминия(0,001 раствор) 0,001 физиологический раствор остальное Пример 2. Инактивированную ассоциированную вакцину против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей используют внутримышечно однократно при следующих соотношениях компонентов антиген из штаммаВ-0240(20109 КОЕ/см 3) 22,5 гель гидрата окиси алюминия(0,001 раствор) 0,0015 физиологический раствор остальное Пример 3. Инактивированную ассоциированную вакцину против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей используют внутримышечно однократно при следующих соотношениях компонентов антиген из штаммаВ-0240(20109 КОЕ/см 3) антиген из штаммаВ-0199 гель гидрата окиси алюминия(0,001 раствор) 0,002 физиологический раствор остальное Пример 4. Инактивированную ассоциированную вакцину для профилактики мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей готовят на основе штаммовВ-0240,В 0242 иВ-0199. Для изготовления одной серии вакцины используют отдельные ампулы с лиофилизированной культурой стрептококка серологической группы С штамма В-0240,В-0242 иВ-0199. Содержимое ампул в отдельности высевают на мясо-пептонном агаре (МПА) с добавлением 10 сыворотки крови лошади и 1 глюкозы в 3-4 чашки Петри по следующей методике 0,1-0,2 см 3 суспензии культуры штамма вносят на поверхность агара и стеклянным стерильным шпателем распределяют ее на поверхности агара. Этим же шпателем проводят по поверхности агара последовательно еще трех чашек. Посевы на МПА инкубируют 48 часов при 37 С. Одновременно делают высевы на мясо- пептонный бульон, бульон Хоттингера и среду Сабуро по две пробирки с каждой средой и инкубируют при тех же температурных режимах (на среде Сабуро при 24 С)- посевы на среде Сабуро 10 суток, а на МПБ 3 суток. По истечении срока инкубации культуры в каждой питательной среде в отдельности проверяют на чистоту и характер роста визуальным просмотром мазков. Рост культур на питательных средах должен быть характерным для возбудителей мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей,соответственно. Из культур, выросших на чашках Петри,отбирают 2-3 колонии стрептококков, пастерелл и сальмонелл в отдельности и высевают в МПБ с добавлением 10 сыворотки крови лошади и 1 глюкозы и инкубируют при температуре 37 С 18-24 часа. Проверяют чистоту роста просмотром мазков,окрашенных по Граму и высевают на МПБ с 10 сыворотки крови лошади и 1 глюкозы во флаконы в соотношении 1100. Для приготовления маточной расплодки из флаконов суточные бульонные культуры стрептококков,пастерелл и сальмонелл в отдельности пересевают в подогретый до температуры 37 С МПБ с 10 сыворотки крови лошади и 1 глюкозы в 2,5 литровые бутыли из расчета 100 см 3 на 10 литров. Посевы культивируют при температуре 37 С в течение 24 часов. При удовлетворительных показателях чистоты, и оптической концентрации, к жидкому концентрату производственной культуры вносят 0,3-ный раствор коммерческого формалина. Инактивацию культур проводят в течение 24 часов 4 при температуре 45 С, подвергая взбалтыванию каждую бутыль до 4-5 раз в течение 2 минут. После инактивации отбирают пробы культур из каждого бутыля в отдельности для контроля полноты инактивации и определения концентрации микробных клеток. Для этого проводят посевы в пробирки с МПБ и МПА с 10 сыворотки крови лошади и 1 глюкозы. Посевы не должны иметь роста в течение 10 дней наблюдения. Концентрацию микробных клеток определяют по оптическому стандарту мутности, которая должна быть 201,0 млрд микробных клеток в 1 см 3 для пастерелл и сальмонелл, и 301,0 млрд микробных клеток в 1 см 3 для мытных стрептококков, а несвязанного формалина должно быть не более 0,09. По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты (полноты инактивации) биомассы стрептококков, пастерелл и сальмонелл сливают в 20 литровые бутыли в соотношении 111 и в общую бактериальную массу вносят стерильный адъювант - 3-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОСТ 1828-81) из расчета содержания 1,5-2,0 мг в 1 см 3 культуры, а также для консервирования добавляют азид натрия из расчета содержания 110000. 3-ный раствор гидроокиси алюминия на физиологическом растворе стерилизуют в автоклаве при температуре 120 С в течение 30 минут. Адъювант вносят при непрерывном помешивании культуры. Через трое суток после внесения адъюванта формируют серию вакцины,готовой вакцины должен быть в пределах 7,2-7,4. Расфасовку вакцины производят по 100, 200 см 3 в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками,обеспечивая герметичность упаковки содержимого флаконов. Для определения качества вакцины делают выборку из разных мест серии в количестве 10 флаконов, из которых 5 используют для проведения испытаний, а 5 флаконов хранят в архиве в течение 18 месяцев. Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонней примеси,хлопьев,плесени,неразбивающегося осадка, флаконы с вакциной тщательно встряхивают и просматривают визуально в проходящем свете. Одновременно флаконы проверяют на герметичность укупорки и правильность этикетирования. Концентрацию водородных ионов определяют рН-метром-340 или другим прибором. Для испытания используют 3 флакона с вакциной. Содержимое каждого флакона испытывают отдельно. Определениевакцины проводят по инструкции, приложенной к прибору. Вакцина должна иметьв пределах 7,2-7,4. Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посевы проводят из каждого флакона в две пробирки с МПА и МПБ в объеме 0,2-0,3 см 3 вакцины. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 дней, отсутствие роста говорит о стерильности препарата. Безвредность вакцины проверяют на белых мышах со средней массой 18-20 г. Три флакона с вакциной встряхивают и из каждого флакона с вакциной с соблюдением стерильности отбирают 20-25 см 3 препарата, переносят в стерильный флакон, общую пробу используют для определения безвредности и иммуногенности. Для определения безвредности содержимое флакона тщательно встряхивают и вводят 10 белым мышам подкожно в области спины в объеме 0,5 см 3. Вакцина не должна вызывать заболевания и гибели белых мышей в течение 10 дней. Для определения иммуногенной активности общую пробу вакцины во флаконе встряхивают и вводят 30 белым мышам массой 18-20 г подкожно с наружной стороны бедра в дозе 0,2 см 3. Через 21 дней после иммунизации 30 вакцинированных и 30 контрольных белых мышей аналогичной массы заражают подкожно в области бедра вакцинными штаммами стрептококков, пастерелл и сальмонелл в дозе 5 ЛД 50 в отдельности (по 10 мышей). Срок наблюдения 10 дней. Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания и гибели не менее 8 иммунизированных мышей в каждой опытной группе, при заболевании всех и гибели не менее 28 белых мышей в контрольных группах в течение 10 дней. Предлагаемая ассоциированная вакцина безвредна,не вызывает осложнений у вакцинированных животных, обладает высокой активностью и профилактирует развитие клинических признаков мыта, пастереллеза и сальмонеллеза у лошадей до 95 . Использование инактивированной ассоциированной вакцины против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей позволит создать у привитых животных иммунитет такой же напряженности, как и моновакцины против мыта,пастереллеза и сальмонеллеза, а также сократит число прививок в 3 раза, обеспечит одновременное создание иммунитета против 3 болезней за 7- 14 дней по сравнению с 1,5-2,5 месяца при последовательной моновакцинации, а также снизит затраты труда и потери живой массы от стрессфакторов, связанных с иммунизацией. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Инактивированная ассоциированная вакцина против мыта, пастереллеза и сальмонеллеза лошадей, включающая антигены из штаммов,, гидрат окиси алюминия, формалин и физиологический раствор, отличающаяся тем, что в качестве антигенов используют штаммыВ 0240,В-0242 и дополнительно антигенВ-0199, а в качестве консерванта дополнительно азид натрия при следующих соотношениях компонентов, мас.антиген из штаммаВ-0240(20109 КОЕ/см 3) гель гидрата окиси алюминия