Инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей

(51) 61 39/116 (2006.01) 61 31/10 (2006.01) 12 1/14 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ инактивированной ассоциированной вакцины против двух видов возбудителей дерматомикозов. Инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей,включающая антигены из штаммов грибови, и адъювант на физиологическом растворе, в качестве антигенов используют штаммы грибов-0181 и-0182, а в качестве консерванта глицерин и формалин при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штамма-0181(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 10,0-15,0 гель гидрата окиси алюминия(72) Умитжанов Мынбай Боранбаева Райхан Султанмуратовна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ИНАКТИВИРОВАННАЯ АССОЦИИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ТРИХОФИТИИ И МИКРОСПОРИИ ЛОШАДЕЙ(57) Изобретение относится к области биотехнологии,микологии,микробиологии,иммунологии, а именно противомикологических вакцин и может быть использовано для активной профилактики и лечения трихофитии и микроспории лошадей. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной Изобретение относится к области биотехнологии,микологии, микробиологии, иммунологии, а именно противомикологических вакцин и может быть использовано для активной профилактики и лечения трихофитии и микроспории лошадей. Известна инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей, включающая антигены из штамма грибаи штамма, и адъювант на физиологическом растворе/. 60, 21.02.2013 г Недостатком инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадей, является е низкая профилактическая и лечебная эффективность применяемого штамма грибаВИЭВ 473. Задачей изобретения является повышение иммуногенности вакцины и расширение диапазона эффективности специфической профилактики и лечения трихофитии и микроспории лошадей к разным видам грибов родови. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении стабильной,безвредной и высокоэффективной инактивированной ассоциированной вакцины против двух видов возбудителей дерматомикозов. Инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей,включающая антигены из штаммов грибови, и адъювант на физиологическом растворе, в качестве антигенов используют штаммы грибов-0181 и-0182, а в качестве консерванта глицерин и формалин при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штамма-0181(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 10,0-15,0 гель гидрата окиси алюминия(98 химически чистый) 8,0-12,0 формалин 8,0-12,0 физиологический раствор остальное. Штаммы грибов, используемые для изготовления инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадей,депонированы в лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО КазНИВИ и обладают следующими свойствами. Штамм гриба-0181. Культуральные свойства. Молодые 7-дневные колонии совершенно гладкие, ровные. Колония на средах с триптофаном или никотиновой кислотой растет быстро, к 10-му дню достигает диаметра 2060 мм, на среде Саубуро - 10-15 мм. После 10-14 дней становятся складчатыми, иногда с трещинами,2 бархатисто-пушистыми, беловатыми. Бахромчатые,погруженные в субстрат края колонии желтоватого цвета, иногда блестящие. Обратная сторона колоний желтовато-оранжевая в зрелых и старых культурах розовато-красноватая. Мицелий септированный,ветвящиеся, шириной до 3,5 мкм, редко завитки(спирали и кольцевидные) окончания гиф и интеркалярными хламидоспорами диаметром 3,5-103-4 мкм. Микроконидии многочисленные, округлые или продолговатые, овальные, грушевидные, нередко булавовидные на тонких коротких ножках расположены по бокам мицелий. Средние размеры их 3-72-3 мкм. Макроконидии встречается редко по форме они слегка булавовидные, удлиненно-овальные с тупым наружным концом, 1-4-клеточные (перегородками),тонкостенные, гладкие размером 3-715-45 мкм. Многочисленные хламидоспоры встречаются в старых культурах и достигают от 12 до 16 мкм в диаметре, единичные. Артроспоры отсутствуют. Биохимические свойства. Штамм гриба-0181 КазНИВИ 14/1,хорошо растет в присутствии триптофана,никотинамида, никотиновой кислоты или ее эквивалентов, имеющихся, в лошадином волосе,избирательно поражаемом данным грибом. На волосах других многочисленных животных гриб развивается лишь при условии добавления к ним раствора никотиновой кислоты. Культивирует при температуре 28-35 С в течении 10-14 дней. В этих условиях наблюдается ускорение лагфазы и усиливается накопление биомассы (у эталонного штамма за 18 сут). Бахромчатые, погруженные в субстрат края колонии желтоватого цвета, иногда блестящие. Обратная сторона колоний желтоватооранжевая в зрелых и старых культурах розоватокрасноватая. Из числа углеводов плохо усваивается сахароза. Факторами роста является триптофан,никотинамида, никотиновой кислоты и др. Элементами питания является азот, углерод,водород,кислород,а наиболее важные микроэлементы -фосфор и сера. Все эти микро- и макроэлементы участвуют во всех биохимических реакциях, происходящих в клетках. Сероводород и индол не образуют. Антигенные свойства. На введения культуры штамма в организме лошадей, кроликов и морских свинок образуются специфические агглютинины в титрах 140- 11280. Маркерные признаки. Биохимические - на суслоагаре при рН 7,2-7,4 до концентрации 300 - 350 млн/см 3. Микроконидии многочисленные,округлые(продолговатые), овальные, грушевидные, нередко булавовидные на тонких коротких ножках расположены по бокам мицелия. Средние размеры их 3-72-3 мкм. Макроконидии встречается редко по форме они слегка булавовидные, удлиненно - овальные с тупым наружным концом,1-4-клеточные Физиологические хемогетеротроф. По отношению к кислороду аэроб. Не обладает метаболическими свойствами. В минеральном питании для основного обмена грибов, необходимо азот, углерод, кислород, водород, сера, фосфор,калий, магний, железо, медь, цинк, марганец,молибден, кальций, кобальт, галлий, бор, скандий,ванадий. Иммунохимические - в реакциях РСК и РИГА титры антител составляет от 140 до 1 1280 отличается от эпизоотических штаммов слабой вирулентностью, высокой спорогенностью и активностью при внутримышечном введении. Патогенные свойства.0181 КазНИВИ 14/1, патогенный для лошадей,свиней и лабораторных животных. Иммуногенность. При двукратном внутримышечном введении штамма в дозе 20106 микроконидии создают напряженный иммунитет у привитых лошадей, кроликов и морских свинок к последующему заражению трихофитией с продолжительностью не менее 12 месяцев. Безвредность. Штамм гриба-0181 КазНИВИ 14/1, безвреден для лошадей, кроликов и морских свинок в дозе 20106 микроконидии при внутримышечном введении. Реактогенность. Штамм гриба-0181 КазНИВИ 14/1, слабореактогенен для лошадей при внутримышечном введении. У привитых животных спустя 2-3 недели на месте инъекции развивается специфически локализованный поверхностный очажок диаметром 1,0-1,5 см, который самопроизвольно излечивается в течение двух недель. Спророобразование. Максимальный уровень спорообразования на сусло-агаре 300-350 млн/см 3. Реверсабельность и реактогенность. Штамм гриба отличается от эпизоотических изолятов слабой вирулентностью, отсутствием заражения при контакте между животными, высокой активностью при внутримышечном введении. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма гриба-0181 КазНИВИ 14/1,стабильно сохраняются на протяжении 5 лет при условии редких пересевов (2-3 раза в год) не ослабляет патогенные свойства. Сохраняемость в лиофильно-высушенном состоянии в присутствии 10 сахарозы и 1,5 желатина или жидкого обезжиренного молока штамм гриба-0181 КазНИВИ 14/1, не снижает активности при температуре 2-10 С в течении 12 месяцев в нативном состоянии в течении 6 месяцев, в замороженном при минус 40 С в течении 6 месяцев,при ниже минус 20 С в течении 2 лет. После растворения из лиофилизированного состояния физиологическим раствором хлорида натрия или дистиллированной водой при рН 7,2-7,4 гриб сохраняет биологическую активность при температуре 28-35 С в течении 5 час, при 4 С - 3 сут. Штамм гриба-0182. Морфологические признаки. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 обладает морфологическими признаками,характерными для возбудителя микроспории лошадей. Окрашенные по Граму культуры гриба грамположительные. Культуральные свойства. Культуры гриба быстрорастущие, рост колонии наблюдается на 2-5-й день в виде маленького пушистого возвышения, окруженный зоной белесоватого пушка к 10-му дню достигают диаметра 4-5 см. Растущий штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 ветвящийся, беловатый, сероватый или бежевый, пушистый, бархатисто- мучнистый,распростертый,овальный,растущий край воздушного мицелия паутинистый. Размеры шириной 0,6-3,5 мкм, септированный, изогнуты,иногда гифы ракетообразные. микроконидии немногочисленные,овальные,грушевидные,размером 3-62,5-3,5 мкм, сидящие или прикрепленные короткими ножками, встречаются не постоянно, располагаются на конидиеносцах различного размера макроконидии многочисленные,веретеновидной формы с вытянутыми концами, с толстостенной гладкой или зубчатой оболочкой, с 8-12 перегородками,размером 50-12015-25 мкм, располагающихся иногда на равном расстоянии одна от другой по ходу мицелия. Артроспоры гриба единичные или отсутствуют. Хламидоспоры округлые,интеркалярные диаметром 8-12 мкм, располагаются на равном расстоянии друг от друга по ходу мицелия, единичные или отсутствуют. Биохимические свойства. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 состоит из углеводов, постоянно усваивает сахарозу,глюкозу, мальтозу, манит фактором роста являются - тиамин, никотиновая, патнтотеновая,парабензойные кислоты. Стимулятором роста железо, цинк, марганец, медь, молибден, кальций,кобальт, никель, бор и др. Сероводород и индол не образует. Антигенные свойства. На введение культуры штамма в организме кошек, собак и пушных зверей(кроликов) образуются специфические агглютинины в титрах 140 - 1 1280. Маркерные признаки. Физиологические хемогетеротроф. По отношению к кислороду аэроб. Пептоны, аспарагин, глутоминовая кислота,сусло агар, аминокислоты, углеводы сахароза,глюкоза, мальтоза, маннит факторы роста (тиамин,никотиновая, пантотеновая, парабензойная кислоты и др.) стимуляторы роста (железо, цинк, марганец,медь, молибден, кальций, кобальт, никель, бор и др.). Биохимические - на сусло агаре при рН 7,2-7,4 до концентрации 60 - 145 млн/см 3 макроконидии многочисленные,овальные размером 15-2550-120 мкм микроконидии округлые или грушевидные, иногда продолговатые, размер 3-62,6-3,5 мкм, встречается не постоянно. Иммунохимические - в реакциях РСК и РИГА титры антител составляет от 140 до 1 1280 3 отличается от эпизоотических штаммов слабой вирулентностью, высокой спорогенностью и активностью при внутримышечном введении. Патогенные свойства. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 патогенен для лошадей, кошек, собак, пушных зверей и мышевидных грызунов. Иммуногенность. При двукратном внутримышечном введении названного штамма в дозе 20106 макроконидии создает напряженный иммунитет у привитых лошадей, кошек, собак и пушных зверей (кроликов) к последующему заражению микроспории продолжительностью не менее 12 месяцев. Безвредность. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 безвреден для лошадей, кошек, собак и пушных зверей (кроликов) в дозе 20106 макроконидии при внутримышечном введении. Реактогенность. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 слабореактогенен для лошадей, кошек, собак и пушных зверей(кроликов) при внутримышечном введении, так как вакцина приготовлена из убитых(инактивированных) клеток дерматофитов. У привитых животных спустя 15-25 дней на месте инъекции развивается небольшой специфически локализованный поверхностный очажок, который самопроизвольно излечивается в течении 2-3 недель. Спорообразование. Максимальный уровень спорообразования на суслоагаре 60-145 млн/см 3. Реверсабельность и реактогенность. Штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 отличается от эпизоотических изолятов слабой вирулентностью, отсутствием заражения при контакте между животными, высокой активностью при внутримышечном введении животным. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма гриба-0182 КазНИВИ 15 стабильно сохраняются на протяжении года (при 23-х кратном пассаже в течении года) при пассаже культуры на питательных средах (срок наблюдения). Сохраняемость в лиофильно-высушенном состоянии в присутствии жидкого обезжиренного молока или 10 сахарозы и 1,5 желатина штамм гриба-0182 КазНИВИ 15 не снижает активности при температуре 2-10 С в течении 12 месяцев, в нативном состоянии в течении 6 месяцев, в замороженном при минус 40 С в течении 6 месяцев, при минус 20 С ниже в течении 2 лет. После растворения из лиофилизированного состояния физиологическим раствором хлорида натрия или дистиллированной водой с рН 7,2-7,4 гриб сохраняет биологическую активность при температуре 26-28 С в течении 5 часов, при 4 С - 3 сут. Пример 1. Для получения инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадей берут 18 сут культуру штамма-0181 и 16 сут культуру штамма-0182, и 4 выращивают раздельно в матровых колбах на суслоагаре при рН 7,2-7,4 и температуре 28 С в течение 18 дней. Выращенную грибницу каждой культуры в условиях асептики снимают с поверхности питательной среды стеклянными грибными скребками и помещают в стерильные банки. На каждый собранный вакцинный штамм добавляем по 300,0 см 3 стерильный физиологический раствор. Грибную массу каждого штамма гомогенизируют в миксерах, затем с помощью стерильного физиологического раствора,полученные грибные гомогенаты 2-х штаммов инактивируют 3-ным формалином и соединяют в равных объемах. Затем дополнительно подвергают разрушению ультразвуком на УЗДН-А частотой волн 22 кГц, интенсивностью 100 Вт/см 2 в течении 30 мин - 1 часа. После разрушения гомогенная масса помещается в холодильник при температуре 4-8 С в течении 1 сут. Затем берется проба для микроскопического анализа на наличие не разрушенных спор с последующим посевом на питательные среды. После этого берутся 3 пробы для бактериологического и микологического контроля в дозе 1,0 см 3. Далее полученную гомогенную массу центрифугируют при 6000 об/мин в течении 20 мин. Верхний слой гомогената необходим для изготовления инактивированной ассоциированной вакцины. С помощью фотоэлектро-колориметром определяют концентрацию полученного белка в 1,0 см 3 полученного супернатанта. После к грибной суспензии антигена на солевом растворедобавляют гель гидрата окиси алюминия (8-12) по сухому веществу. Посуточную смесь ставят в термостат до 1 суток и время от времени перемешивают 3-5 раз. После этого к вакцине добавляют глицерин (98 химически чистый) из расчета 8-12 от объема гомогената. Все тщательно перемешивают, разливают по 2,0 см 3 в стерильные ампулы объемом 2,0-5,0 см 3, запаивают в стерильных условиях с помощью газовой горелки, и этикетируют. Пример 2. Инактивированную ассоциированную вакцину против трихофитии и микроспории лошадей используют внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штамма-0181(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 10,0 гель гидрата окиси алюминия(98 химически чистый) 8,0 формалин 8,0 физиологический раствор остальное. Пример 3. Инактивированную ассоциированную вакцину против трихофитии и микроспории лошадей используют так же, как в примере 2 при следующих соотношениях компонентов, мас.(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 12,0 гель гидрата окиси алюминия(98 химически чистый) 10,0 формалин 10,0 физиологический раствор остальное. Пример 4. Инактивированную ассоциированную вакцину против трихофитии и микроспории лошадей используют так же, как в примере 2 при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штамма-0181(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 15,0 гель гидрата окиси алюминия(98 химически чистый) формалин 12,0 физиологический раствор остальное. Готовая инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей представляет собой жидкость коричневатожелтоватого цвета. Вакцина сохраняет свои биологические свойства при условии хранения в закрытых сухих, темных помещениях при температуре 2-10 С. Срок годности вакцины 24 месяца со дня окончании разлива вакцины. Пример 5. Для изучения иммуногенной активности инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадей будет изучено на кроликах. Опытной группе вводят внутримышечно по 1,0 см ресуспензированной инактивированной ассоциированной вакцины в область крупа дважды сначало с левой, а потом с правой стороны бедренным группам мышц с интервалом 10-14 дней. Спустя 25-28 дней после второй иммунизации, все 5 голов кроликов опытной группы, а также 3 головы из контрольной группы (не иммунизированных животных) экспериментально заражают вирулентными эпизоотическими культурами двух видов культур из родаи . В течении 30-35 дней за опытной контрольной группой животных ведут наблюдение,а клинический осмотр животных осуществляют через каждые 3-5 дней. От животных с клиникой трихофитии и микроспории отбирают патологический материал, при трихофитии и микроскопии которого и высевы на питательные среды уточняют визуально полученный диагноз заболевания данных животных дерматомикозами. При обнаружении у животных трихофитии и микроспории, а также подтверждения диагноза,животных подвергают двух или трехкратному введению терапевтической дозы жидкой инактивированной ассоциированной вакцины в тех же интервалах, что и профилактические дозы данного биологического препарата. Результаты проведенной работы учитываются спустя 25-30 дней после второй иммунизации заболевших животных терапевтической дозой инактивированной ассоциированной вакциной против трихофитии и микроспории лошадей Результаты иммуногенной активности (профилактической и терапевтической дозы) инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадей отражены в таблицах 1 и 2. Из таблиц 1 и 2 видно,что инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей при ее проверке на иммуногенную активность проявила высокую профилактическую и терапевтическую эффективность, в том числе и при лечении заболевших животных с явной клинической формой трихофитии и микроспории животных. Использование предлагаемой вакцины в ветеринарной практике позволит повысить эффективность мероприятий по профилактике и терапии лошадей от разных видов возбудителей дерматомикозов (трихофитии и микроспории) лошадей в Республике Казахстан. Таблица 1 Профилактическая эффективность инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадейп/п Результаты опытов (количество заболевших животных при экспериментальном заражении вирулентными эпизоотическими культурами грибов родови) Не заболело Заболело Диагноз подтвердился Диагноз не подтвердился Опытные группы (дважды иммунизированные животные) Кролики 5 5 Контрольные группы (не иммунизированные животные) Кролики 5 5 Таблица 2 Проверка терапевтической эффективности инактивированной ассоциированной вакцины против трихофитии и микроспории лошадейп/п ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Инактивированная ассоциированная вакцина против трихофитии и микроспории лошадей,включающая антигены из штаммов грибови, и адъювант на физиологическом растворе,отличающаяся тем, что в качестве антигенов используют штаммы грибов 0181 и-0182, а в качестве консерванта глицерин и формалин при следующих соотношениях компонентов, мас. антиген из штамма-0 181(1,0 мг белка в 1,0 см 3 вакцины) 10,0-15,0 гель гидрата окиси алюминия Результаты исследования выздоровело Не выздоровело 5 0