Способ получения препарата для диагностики эхиноккоза

(51) 61 39/00 (2010.01) 61 39/395 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование, с последующим отделением центрифугата, осаждение антигена спиртом,ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, при этом полученным эхинококкозным антигеном,дополнительно содержащем экстракт антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист, осуществляют иммунизацию продуцентов,получают антисыворотку, выделяют эхинококкозные антитела,иммунизируют ими другую группу животныхпродуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, при этом, иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7 й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно,иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50-ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3. Предлагаемый способ позволяет получить более активный препарат для диагностики эхинококкоза.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Тулемисова Жанара Кенесовна Ибажанова Асем Сериковна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Балгимбаева Айжан Ильясовна Каташева Жанат Чамаевна Хусаинов Дамир Микдатович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Иммунологическая диагностика в профилактике эхинококкоза животных и человека в Казахстане (рекомендации). Алма-Ата, Кайнар,1980, с. 18(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭХИНОКОККОЗА(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики эхинококкоза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении более активного препарата для диагностики эхинококкоза,адаптированного к использованию в ИФА. Способ получения препарата для диагностики эхинококкоза, включающий отбор эхинококковых 23845 Изобретение относился к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики эхинококкоза животных. Известен способ получения препарата для диагностики эхинококкоза,путем отбора эхинококковых цист, выделения сколексов, их гидролиза пепсином, центрифугированием, с последующим отделением центрифугата, осаждения антигена спиртом,ресуспендирования в дистиллированной воде и лиофильного высушивания. (Иммунологическая диагностика в профилактике эхинококкоза животных и человека в Казахстане (рекомендации). Алма-Ата, Кайнар,1980, с. 18.). Недостатком способа является низкая активность препарата при диагностике эхинококкоза, и невозможность использования в более чувствительных серологических тестах (ИФА). Задачей изобретения является разработка способа получения более активного препарата для диагностики эхинококкоза, адаптированного к использованию в ИФА. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении более активного препарата для диагностики эхинококкоза,адаптированного к использованию в ИФА. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения препарата для диагностики эхинококкоза, включающим отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование,с последующим отделением центрифугата, осаждение нтигена спиртом,ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, полученным эхинококкозным антигеном,дополнительно содержащем экстракт антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист,осуществляют иммунизацию продуцентов,получают антисыворотку, выделяют эхинококкозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела,при этом,иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенно, иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле,выделение гаммаглобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50-ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг/см 3. Антиидиотипические антитела являются зеркальным отражением специфичности соответствующих антител,могут служить имитатором определенной антигенной детерминанты, и могут быть использованы в целях иммунодиагностики и в качестве вакцинных препаратов. Общепринятая ныне технология получения диагностикумов с использованием антигенов связана с большими методическими трудностями получением большого количества эхинококковых цист, фракционированием полученных антигенов,адсорбцией антисывороток. Поэтому перспективным является получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител. При этом небольшое количество полученного высококачественного антигена, достаточное для получения антител к нему,может обеспечить получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител, как для индикации антигена, так и для обнаружения антител. Пример получение препарата для диагностики эхинококкоза Препарат для диагностики эхинококкоза получают следующим образом. 1 Этап. Техника получения нормального антигена. Из уха здорового кролика берут кровь спиртовоксилоловым методом, добавляют трилон - Б(2 мг см 3), центрифугируют 3-5 - кратно при 3000 об., с отмыванием изотоническим раствором натрия хлорида. Полученные эритроциты лизируют путем добавления пяти объемов дистиллированной воды, 3- 5 кратным попеременным замораживанием и оттаиванием,с последующей обработкой ультразвуком до получения гомогенной суспензии(при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Строму эритроцитов выделяют путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 12000 об., и отмывают от гемоглобина. Строма эмульгировалась в таком количестве физиологического раствора,чтобы 1 мл эмульсии содержал строму из 1 см 3 эритроцитов, и использовалась в качестве нормального антигена. 2 Этап. Техника получения эхинококкозного антигена. Из пораженных ларвальным эхинококкозом органов животных (овец, свиней или крупного рогатого скота) отбирают эхинококковые цисты. Цисты, изолированные от тканей хозяина,вскрываются, жидкая часть сливается в кювету,получается пузырная жидкость. Далее внутреннюю часть цист соскабливают бранашами пинцета и сколексы вымывают в кювет с помощью 0,9 стерильного раствора натрия хлорида до соотношения 15 - получается суспензия сколексов. У отмытых оболочек цист отделяется внутренняя герминативная оболочка - получаются кусочки герминативной оболочки. Оставшаяся часть эхинококковой цисты уничтожается. Кусочки герминативной оболочки подвергают гомогенизации при 5 тыс. об/мин, в течение 3-5 минут ресуспендируются в 0,9 стерильном растворе натрия хлорида в соотношении 15. На каждый литр приготовленной суспензии герминативной оболочки добавляют 25-30 мл 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 мл толуола, смесь 2 23845 тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1- нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученная жидкость, содержащая сколексы представляет собой суспензию. На каждый литр суспензии сколексов добавляют 25-30 мл 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 мл толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3.0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1-нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Пузырная жидкость подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученные фильтраты герминативной оболочки, сколексов и пузырной жидкости смешивается в соотношении 111. Из полученной смеси осаждается антиген путем добавления 4 объемов 96 спирта этилового (ректификата) при комнатной температуре. При этом рН среды доводится до 7-7,2 путем добавления 1-нормального раствора химически чистого едкого натрия (в начале 1 мл, затем по каплям), с целью получения лучшего осаждения антигена. Через 20-24 часа выдерживания при температуре 4-6 С, выпавший осадок (антиген) собирается центрифугированием при 3-5 тыс. оборотов в течение 10-15 минут. Надосадочный спирт сливается, а осадок (антиген) в начале с небольшим количеством дистиллированной воды(50 мл) тщательно растирается в сметанообразную массу, а за тем переливается в цилиндр,куда добавляется 950 мл дистиллированной воды. Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы или ампулы, закрывается стерильными ватными тампонами и подвергается лиофильной сушке. Ампулы запаиваются, а флаконы закрываются стерильными пробками и обкатываются алюминиевыми колпачками Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы. Антиген контролируют на стерильность,используя специальные питательные среды(отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РСК и РНГА. 3 Этап. Техника получения антисыворотки. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют эхинококкозным антигеном по следующей схеме 1 й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3, 7-й день внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день -внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после начала иммунизации,контролируют титр преципитирующих антител в реакции количественной преципитации (РКП). При достижении титра антител не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см 3 крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следующего цикла иммунизаций. Если титры антител ниже указанных, то также проводят дополнительную внутривенную иммунизацию животных по схеме через 2 день. При достижении титра антител после второго цикла иммунизации не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 4050 см 3 крови, трехкратно, с интервалом 72 часа затем делают перерыв до следующего цикла иммунизаций. 4 Этап. Сорбция балластных антител. Полученные порции антисывороток кроликов объединяли, и проводили сорбцию эхинококкозных антител по методу .. . (1969). Процесс сорбции эхинококкозных антител проводился в два этапа вначале с использованием иммуносорбента,приготовленного из нормального кроличьего антигена,которым проводили извлечение 3 23845 балластных антител, а затем с использованием иммуносорбента, приготовленного на основе эхинококкозного антигена которым извлекали эхинококкозные антитела. При этом использовали иммуносорбенты с инкорпорированным в гранулы полиакриламидного геля нормальным эхинококкозным антигеном. Оптическую плотность полученного элюата определяли на спектрофотометре СФ-26 и одновременно подсчитывали количество белка в каждой порции. Впоследствии эти эхинококкозные антитела использовали для иммунизации другой партии кроликов с целью получения антиидиотипа против эхинококкозных антител. Выделенные антителаобессоливают диализом,затем концентрируют в диализных трубках против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 600) до содержания белка не менее 1,0 мгмл и хранят при - 20 или лиофильно высушивает. 5 Этап. Техника получения диагностикума. Полученный гамма-глобулин или очищенные на иммуносорбенте антитела (-1) смешивают с ПАФ в соотношении 11 (содержание в 1 см 31 мг гамма-глобулина или 200 мг антител). Этой смесью иммунизируют кроликов, иммунизируют в 1-й день- антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую. На 7-й день иммунизируют антителами внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-день внутривенную иммунизацию кроликов антителами по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. На 7-9 день после реиммунизации, при титре антител не менее 200 мкгмл. определенным РКП, у кроликов брали кровь из краевой ушной вены спиртксилольным методом по 40 мл, трехкратно, с интервалом 72 часа, и отделяли сыворотку. Иммуносорбент был приготовлен по методике А.Н. Маянского с соавт. (1976) с включением дистиллированной воды в матрицу полиакриламидного геля, который использовали для контроля качества сорбции антител из антиидиотипов. Процесс сорбции антиидиотипических антител проводили по методике.в два этапа. Вначале проводили исключение балластных антител. Для этого 10 мл антисыворотки разводили забуференным физиологическим раствором в соотношении 13, приливали к ней Иммуносорбент,приготовленный с включением в матрицу полиакриламидного геля дистиллированной воды,устанавливали на магнитную мешалку на 1 час. По истечении часа содержимое центрифугировали, к надосадку приливали иммуносорбент,приготовленный с включением идиотипа в матрицу полиакриламидного геля, устанавливали опять на 1 час на магнитную мешалку. Затем сорбент промывали 5 раз забуференным физиологическим раствором в центрифуге при 3000 об/мин. Для элюции балластных антител использовали 4 мл лимоннофосфорнокислого буфера (рН 2,6). Элюцию проводили дважды удаляя балластные антитела. По истечении 1 часа сорбции антител на магнитной мешалке, проводили однократное центрифугирование смеси в течение 5 минут при 300 об/мин. Осадок промывали 5 минут при 3000 об/мин. Элюцию проводили дважды и получали из каждых 10 мл антисыворотки 5 мл антиидиотипических антител. Затем определяли в каждой порции антител оптическую плотность и рассчитывали количество белка, после чего антитела нейтрализовали трис - НС до значения 7,0-7,2. Степень очистки контролировали спектрофотометрически, исследуя промывные воды после десорбции с иммуносорбентом промывных вод, содержащих антиизотипы и антиаллотипы. При показании спектрофотометра 0,01-0,02 сыворотка считается очищенной. Далее путем высаливания 50-ным сульфатом аммония выделили гамма-глобулиновую фракцию,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мгмл. Полученную серию препарата расфасовывали в ампулы по 2 см 3 с содержанием белка 10 мг/мл,подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. 6 Этап. Испытание эхинококкозного диагностикума. Полученные антиидиотипические антитела испытывали в качестве диагностикума в серологических реакциях (РНГА, ИФА) с отрицательными и положительными эхинококкозными сыворотками. При постановке РНГА для насадки антиидиотипическим иммуноглобулином использовали эритроциты, приготовленные по методике Вайнбаха. Реакцию ставили с сыворотками крови экпериментально зараженных кроликов(отрицательные) Разведения антиидиотипов были от нативного до 164. Разведение диагностикума от 110 до 1320. В результате опыта было установлено,что диагностикум,приготовленный из антнидиотипов, в РНГА можно использовать в разведении 1160. Для постановки ИФА использовали плашки из полистирола. В реакции использовали положительные и отрицательные эхинококкозные сыворотки, антиидиотип (антиген) разводили карбонатным буфером с рН 9,0. После внесения исследуемых сывороток плашки сенсибилизировали альбумином,конъюгацию выделенного антиидиотипа с пероксидазой хрена Олайнского биокомбината проводили по методике... (1974). В качестве субстрата использовали субстрат, предложенный.(1984). Субстрат готовили из смеси ортофенилен диамина(0,4 мг/мл) и перекиси водорода (конечная концентрация 0.005) на цитратном буферном растворе, рН 5,0. Для промывания полистироловых плашек использовали 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2) на физиологическом растворе, содержащий 0,5 г/л твин-80. Выбор оптимальных концентраций антиидиотипа для сорбции проводили в разведениях 4 23845 от 110 до 12560. Учет реакции проводили визуально (по интенсивности окраски субстрата в опыте и контроле). В результате опыта было установлено, что оптимальные условия постановки ИФА гаммаглобулин из антиидиотинов в разведении 1200-1400, исследуемая сыворотка 180 - 1 160. Исследования, проведенные на поголовье 54 овцах и 38 крупном рогатом скоте из благополучных ферм и 47 овцах и 53 крупном рогатом скоте из неблагополучных хозяйств, позволили установить высокую активность эхинококкозного диагностикума, своевременно диагностировать заболевание. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения препарата для диагностики эхинококкоза, включающий отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином,центрифугирование, с последующим отделением центрифугата, осаждение антигена спиртом, ресуспендирование в дистиллированной воде и получение целевого продукта, отличающийся тем,что полученным эхинококкозным антигеном,дополнительно содержащем экстрат антигена из герминативной оболочки эхинококковых цист,осуществляют иммунизацию продуцентов,получают антисыворотку, выделяют эхинококкозные антитела,иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела,при этом,иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенно, иммуносорбцио осуществляют в полиакриламидном геле,выделение гаммаглобулиновой фракции осуществляют путем высаливания 50-ным сульфатом аммония, которую концентрируют в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3.