Способ получения препарата для диагностики трипаносомоза

(51) 61 39/00 (2006.01) А 61 К 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ последующим отделением и очисткой целевого продукта, при этом полученным трипаносомозным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют трипаносомозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, в качестве паразитарного антигена использовали ультразвуковой лизат трипаносом, иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно,иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3. Предлагаемый способ позволяет получить более активный препарат для диагностики трипаносомоза.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Есполов Тлектес Исабаевич Кожаев Аскар Нурсултанович Раимханов Дархан Турдабекович(56) Предварительный патент РК 10889, кл. А 61 К 39/005, А 61 В 10/00, 2001(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТРИПАНОСОМОЗА(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики трипаносомоза животных. Способ получения трипаносомозного диагностикума, включающий заражение возбудителем трипаносомоза животных-продуцентов,с 22023 Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики трипаносомоза животных. Известен способ получения препарата для диагностики трипаносомоза, путем заражения возбудителем трипаносомоза собак, взятие крови,центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, отделение трипаносом от форменных элементов крови и получения диагностикума - трипаносомозного антигена. (Косиченко Л.Г., Кожаков К.К., Кадыров , Сулейменов М.Ж. Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомозов животных,вызываемых видамии. Предпатент РК 10889.// Изобретения. Предварительные патенты./Промышленная собственность. Официальный бюллетень 11.-15.11.2001). Недостатком способа является сравнительно низкая активность диагностикума (1200), и невозможность использования в более чувствительных серологических тестах (ИФА). Задачей изобретения является разработка способа получения высокочувствительного препарата для диагностики трипаносомоза, адаптированного к использованию в ИФА. Задача решается тем, что способ получения препарата для диагностики трипаносомоза предусматривает введение в организм животныхпродуцентов паразитарного трипаносомного антигена, взятием крови, отделением антитрипаносомозной сыворотки с последующим выделением из антисыворотки трипаносомных антител, иммунизацией ими другой группы животных - продуцентов,с последующим взятием крови, отделением сыворотки,выделением антиидиотипических антител, и лиофильным высушиванием. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в улучшении качества целевого продукта, повышении эффективности диагностики. Способ получения трипаносомозного диагностикума, включающий заражение возбудителем трипаносомоза животных-продуцентов, с последующим отделением и очисткой целевого продукта,при этом полученным трипаносомозным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют трипаносомозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов, получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, в качестве паразитарного антигена использовали ультразвуковой лизат трипаносом, иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно, иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония,2 которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3. Антиидиотипические антитела являются зеркальным отражением специфичности соответствующих антител, могут служить имитатором определенной антигенной детерминанты, и могут быть использованы в целях иммунодиагностики и в качестве вакцинных препаратов. Общепринятая ныне технология получения диагностикумов с использованием антигенов связана с большими методическими трудностями получением и содержанием животных с большой паразитемией, фракционированием полученных антигенов, адсорбцией антисывороток. Поэтому перспективным является получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител. При этом небольшое количество полученного высококачественного антигена, достаточное для получения антител к нему, может обеспечить получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител, как для индикации антигена, так и для обнаружения антител. 1. Пример получения препарата для диагностики трипаносомоза А. Техника получения нормального антигена. Из уха здорового кролика берут кровь спиртовоксилоловым методом, добавляют трилон Б (2 мг см 3), центрифугируют 3-5 - кратно при 3000 об., с отмыванием изотоническим раствором натрия хлорида. Полученные эритроциты лизируют путем добавления пяти объемов дистиллированной воды, 3-5 - кратным попеременным замораживанием и оттаиванием, с последующей обработкой ультразвуком до получения гомогенной суспензии(при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Строму эритроцитов выделяют путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 12000 об., и отмывают от гемоглобина. Строма эмульгировалась в таком количестве физиологического раствора, чтобы 1 мл эмульсии содержал строму из 1 см 3 эритроцитов, и использовалась в качестве нормального антигена. Б. Техника получения трипаносомозного антигена. Материалом для получения трипаносомозного антигена служит кровь собак, зараженных эталонным штаммом трипаносом или одним из вирулентных штаммов,выделенных от сельскохозяйственных животных. Для этого полученный штамм поддерживают на белых мышах,с перезаражением 2 раза в неделю. При необходимости получения антигена первоначально заражению подвергают белых крыс путем подкожного ведения 3-4 крысам по 0,5 см 3 цитратной крови. После появления в периферической крови большого количества трипаносом (90 и более в поле зрения), что обычно бывает на 3-4 сутки после заражения, их обескровливают. Собак заражают внутрибрюшинно в среднюю треть живота вблизи белой линии, вводя 40-50 см 3 цитратной крови (от 4-5 крыс), в зависимости от размера животного. 22023 На 2-3 день заражения у собак в периферической крови появляются трипаносомы, количество которых периодически нарастает или уменьшается. Собак необходимо обескровливать в момент первого накопления трипаносом, когда при микроскопическом исследовании крови их находят не менее 80 в поле зрения. Обескровливание проводят путем взятия крови из сонной артерии. При этом всю вытекающую струей кровь собирают в широкий сосуд с 2 -ным цитратом натрия на физиологическом растворе при постоянном перемешивании стеклянной палочкой, из расчета 1 часть крови на 2 части раствора. Полученную после обескровливания собак цитратную кровь фильтруют через двойной марлевый фильтр, в стерильные банки, которые затем ставят в холодильник на 18-24 часа. Отстоявшийся цитрат и плазму отсасывают шприцом в отдельную банку, а осадок тщательно размешивают и подвергают центрифугированию. Центрифугирование производят в предварительно прокипяченных стаканчиках емкостью 80-100 см 3 в течение 15-20 минут при 2-3 тысячах оборотов в минуту. В результате центрифугирования в стаканчике образуется три слоя верхний прозрачный, желтоватый, состоящий из плазмы и цитрата нижний - форменные элементы крови, а на границе между ними -средний, в виде толстой рыхлой массы белого цвета, состоящий из трипаносом. Верхний слой сливают в банку, а трипаносомную массу вынимают при помощи стеклянной палочки или шпателя и переносят в отдельную посуду. Всю собранную трипаносомную массу отмывают 2-3-х кратно, в физиологическом растворе, при 3000-5000 об./мин, по 10 минут каждое. Дезинтеграцию осуществляют в поле ультразвуковых волн низкочастотного диспергатора(УЗДН), при частоте 22 КГц, мощности 75 вт/ см 2 в течение 30 мин. Взвесь разрушенных трипаносом представляющих собой смесь белков протоплазмы и оболочек трипаносом, подвергают центрифугированию при 6 тыс. об/мин в течение 15 минут,отделяя от неразрушенных трипаносом. Полученная надосадочная жидкость является материалом для получения специфического трипаносомозного антигена. Стандартизацию антигена проводят по серологической активности титрацией с гипериммунными трипаносомозными сыворотками. Оптимальный рабочий титр антигена в РСК 1160-1200, а для РП в агаровом геле - исходное разведение. Чувствительность трипаносомозного антигена по обнаружению специфических трипаносомозных антител в сыворотке крови гипериммунных,экспериментально зараженных и спонтанно больных животных характеризуется в РСК в разведении сыворотки 15-1640, а в РП в агаровом геле - одной линией преципитации. Для стабилизации антиген лиофилизируют в рабочем титре с защитной средой. Перед применением антиген растворяют в физиологическом растворе. Б. Техника получения антисыворотки. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют трипаносомозным антигеном по следующей схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3, 7-й деньвнутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день -внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после начала иммунизации,контролируют титр преципитирующих антител в реакции количественной преципитации (РКП). При достижении титра антител не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см 3 крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следущего цикла иммунизаций. Если титры антител ниже указанных, то также проводят дополнительную внутривенную иммунизацию животных по схеме через 21 день. При достижении титра антител после второго цикла иммунизации не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 4050 см 3 крови, трехкратно, с интервалом 72 часа,затем делают перерыв до следующего цикла иммунизаций. В силу того, что предлагаемый способ предполагает многократное использование животныхпродуцентов, с использованием феномена ревакцинации, специфическая активность получаемых сывороток значительно повышается, что повышает эффективность и результативность диагностических тестов. Полученные сыворотки апробированы на чувствительность и специфичность в реакции количественной преципитации (РКП), в сравнении с сыворотками полученными известными ранее способами. В. Сорбция балластных антител. Полученные порции антисывороток кроликов объединяли, и проводили сорбцию трипаносомозных антител по методу . . .(1969). Процесс сорбции трипаносомозных антител проводился в два этапа вначале с использованием иммуносорбента, приготовленного из нормального кроличьего антигена,которым проводили извлечение балластных антител, а затем с использованием иммуносорбента, приготовленного на основе трипаносомозного антигена, которым извлекали трипаносомозные антитела. При этом использовали иммуносорбенты с инкорпорированным в гранулы полиакриламидного геля нормальным и трипаносомозным антигеном. Оптическую плотность полученного элюата определяли на спектрофотометре СФ-26 и 3 22023 одновременно подсчитывали количество белка в каждой порции. Впоследствии эти трипаносомозные антитела использовали для иммунизации другой партии кроликов с целью получения антиидиотипа против трипаносомозных антител. Выделенные антитела обессоливают диализом,затем концентрируют в диализных трубках против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 600) до содержания белка не менее 1,0 мгмл и хранят при - 20 С или лиофильно высушивают. Г. Техника получения диагностикума. 1. Техника иммунизации. Полученный гамма-глобулин или очищенные на иммуносорбенте антитела (АТ-1) смешивают с ПАФ в соотношении 11 (содержание в 1 см 3 1 мг гаммаглобулина или 200 мг антител). Этой смесью иммунизируют кроликов, иммунизируют в 1-й день- антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую. На 7-й день иммунизируют антителами внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенную иммунизацию кроликов антителами по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. На 7-9 день после реиммунизации, при титре антител не менее 200 мкгмл, определенным РКП, у кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл, трехкратно, с интервалом 72 часа, и отделяли сыворотку. 2. Процесс сорбции антиидиотипических антител. Иммуносорбент был приготовлен по методике А.Н. Маянского с соавт. (1976) с включением дистиллированной воды в матрицу полиакриламидного геля, который использовали для контроля качества сорбции антител из антиидиотипов. Процесс сорбции антиидиотипических антител проводили по методике .в два этапа. Вначале проводили исключение балластных антител. Для этого 10 мл антисыворотки разводили забуференным физиологическим раствором в соотношении 13, приливали к ней иммуносорбент,приготовленный с включением в матрицу полиакриламидного геля дистиллированной воды,устанавливали на магнитную мешалку на 1 час. По истечении часа содержимое центрифугировали, к надосадку приливали иммуносорбент,приготовленный с включением идиотипа в матрицу полиакриламидного геля, устанавливали опять на 1 час на магнитную мешалку. Затем сорбент промывали 5 раз забуференным физиологическим раствором в центрифуге при 3000 об/мин. Для элюции балластных антител использовали 4 мл лимоннофосфорнокислого буфера (рН 2,6). Элюцию проводили дважды, удаляя балластные антитела. По истечении 1 часа сорбции антител на магнитной мешалке, проводили однократное центрифугирование смеси в течение 5 минут при 300 об/мин. Осадок промывали 5 минут при 3000 об/мин. Элюцию проводили дважды и получали из каждых 10 мл антисыворотки 5 мл антиидиоти 4 пических антител. Затем определяли в каждой порции антител оптическую плотность и рассчитывали количество белка, после чего антитела нейтрализовали трис- до значения 7,0-7,2. Степень очистки контролировали спектрофотометрически, исследуя промывные воды после десорбции с иммуносорбентов промывных вод,содержащих антиизотипы и антиаллотипы. При показании спектрофотометра 0,01-0,02 сыворотка считается очищенной. Далее путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония выделили гамма-глобулиновую фракцию,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мгмл. Полученную серию препарата расфасовывали в ампулы по 2 см 3 с содержанием белка 10 мгмл, подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. Г. Испытание трипаносомозного диагностикума. Полученные антиидиотипические антитела испытывали в качестве диагностикума в серологических реакциях (РНГА, ИФА) с отрицательными и положительными трипаносомозными сыворотками. При постановке РНГА для насадки антиидиотипическим иммуноглобулином использовали эритроциты, приготовленные по методике Вайнбаха. Реакцию ставили с сыворотками крови экспериментально зараженных собак (положительные) и от здоровых собак (отрицательные). Разведения антиидиотипов были от нативного до 164. Разведение диагностикума от 110 до 1320. В результате опыта было установлено,что диагностикум, приготовленный из антиидиотипов, в РНГА можно использовать в разведении 1160. Для постановки ИФА использовали плашки из полистирола. В реакции использовали положительные и отрицательные трипаносомозные сыворотки, антиидиотип (антиген) разводили карбонатным буфером с рН 9,0. После внесения исследуемых сывороток плашки сенсибилизировали альбумином,конъюгацию выделенного антиидиотипа с пероксидазой хрена Олайнского биокомбината проводили по методике. (1974). В качестве субстрата использовали субстрат, предложенный . (1984). Субстрат готовили из смеси ортофенилен диамина(0,4 мг/мл) и перекиси водорода (конечная концентрация 0,005) на цитратном буферном растворе, рН 5,0. Для промывания полистироловых плашек использовали 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,2) на физиологическом растворе, содержащий 0,5 г/л твин-80. Выбор оптимальных концентраций антиидиотипа для сорбции проводили в разведениях от 110 до 12560. Учет реакции проводили визуально (по интенсивности окраски субстрата в опыте и контроле). В результате опыта было установлено, что оптимальные условия постановки ИФА гамма-глобулин из антиидиотипов в разведении 1200-1400, исследуемая сыворотка 180-1 160. Исследования, проведенные на поголовье 175 животных (лошадях) из благополучных ферм и 64 животных из неблагополучных хозяйств, позволили 22023 установить высокую активность трипаносомозного диагностикума, своевременно диагностировать заболевание на ранних стадиях, и оказать своевременную лечебно-профилактическую помощь. В результате отмечалось повышение упитанности животных, снижение падежа, экономия затрат на лечение. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения препарата для диагностики трипаносомоза, включающий заражение возбудителем трипаносомоза животных-продуцентов, с последующим отделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что полученным трипаносомозным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют трипаносомозные антитела, иммунизируют ими другую группу животных-продуцентов,получают сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, при этом в качестве паразитарного антигена используют ультразвуковой лизат трипаносом, иммунизацию продуцентов осуществляют по схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно,иммуносорбцию осуществляют в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляют путем высаливания 50 ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг/см 3.