Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза

Номер инновационного патента: 22022

Опубликовано: 15.12.2009

Автор: Хусаинов Дамир Микдатович

Скачать PDF файл.

Формула / Реферат

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики пироплазмоза животных.
Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза, включающий заражение животных-продуцентов пироплазмозом, с последующим отделением и очисткой целевого продукта, при этом паразитарным пироплазменным антигеном осу-ществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют антипироплазменные антитела, иммунизируют ими других животных-продуцентов, получают антиидиотипическую сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, в качестве пара-зитарного антигена использовали ультразвуковой лизат пироплазм, иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме: 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см3 в 2 точки ягодичных мышц; 14-й день - внутривенно, иммуно-сорбцию осуществляли в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществ-ляли путем высаливания 50 %-ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг\ см3.
Предлагаемый способ позволяет получить более активный препарат для диагностики пироплазмоза.

Текст

Смотреть все

(51) 61 39/00 (2006.01) А 61 К 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ отделением и очисткой целевого продукта, при этом паразитарным пироплазменным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют антипироплазменные антитела, иммунизируют ими других животныхпродуцентов,получают антиидиотипическую сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, в качестве паразитарного антигена использовали ультразвуковой лизат пироплазм, иммунизацию продуцентов осуществляли по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно, иммуносорбцию осуществляли в полиакриламидном геле,выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляли путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония, которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3. Предлагаемый способ позволяет получить более активный препарат для диагностики пироплазмоза.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Есполов Тлектес Исабаевич Кожаев Аскар Нурсултанович Раимханов Дархан Турдабекович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ПИРОПЛАЗМОЗА(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики пироплазмоза животных. Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза, включающий заражение животныхпродуцентов пироплазмозом, с последующим 22022 Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности к способу получения препарата для серологической диагностики пироплазмоза животных. Известен способ получения препарата для диагностики пироплазмоза, путем заражения восприимчивых спленэктомированных животных-продуцентов кровью животных-пироплазмоносителей,получения крови, отделения эритроцитов и выделения антигена при разрушении эритроцитов, с последующим, согласно изобретению, лиофильным высушиванием биомассы паразитов, добавлением 0,1-1,0 Н раствора натриевой щелочи к навеске лиофильно высушенной биомассы пироплазмид в соотношении 150-100 и доведением рН раствора биомассы до 7,2-7,6 0,1 Н раствором хлористоводородной кислотой. (1210277 А, А 61 К 39/018, 1984). Недостатком способа является низкая активность препарата для диагностики пироплазмоза, и невозможность использования в более чувствительных серологических тестах (ИФА). Задачей изобретения является разработка способа получения более активного препарата для диагностики пироплазмоза, адаптированного к использованию в ИФА. Задача решается тем, что способ получения препарата для диагностики пироплазмоза предусматривает введение в организм животных-продуцентов паразитарного пироплазменного антигена, взятием крови, отделением антипироплазменной сыворотки с последующим выделением из антисыворотки пироплазменных антител, иммунизацией ими другой группы животных - продуцентов, с последующим взятием крови, отделением сыворотки,выделением антиидиотипических антител, и лиофильным высушиванием. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в улучшении качества целевого продукта, повышении эффективности диагностики. Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза, включающий заражение животныхпродуцентов пироплазмозом, с последующим отделением и очисткой целевого продукта, при этом паразитарным пироплазменным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют антипироплазменные антитела, иммунизируют ими других животныхпродуцентов,получают антиидиотипическую сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, при этом в качестве паразитарного антигена используют ультразвуковой лизат пироплазм, иммунизацию продуцентов осуществляют по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,253 в каждую, 7-й день - внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно, иммуносорбцию осуществляют в полиакриламидном геле,выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляют путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония, которую концентрируют в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг см 3. 2 Антиидиотипические антитела являются зеркальным отражением специфичности соответствующих антител, могут служить имитатором определенной антигенной детерминанты, и могут быть использованы в целях иммунодиагностики и в качестве вакцинных препаратов. Общепринятая ныне технология получения диагностикумов с использованием антигенов связана с большими методическими трудностями получением и содержанием животных с большой паразитемией, фракционированием полученных антигенов, адсорбцией антисывороток. Поэтому перспективным является получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител. При этом небольшое количество полученного высококачественного антигена, достаточное для получения антител к нему,может обеспечить получение иммунодиагностических препаратов на основе антиидиотипических антител, как для индикации антигена, так и для обнаружения антител. 1. Пример получения препарата для диагностики пироплазмоза (для диагностики пироплазмоза собак) А. Техника получения нормального антигена Из вены здоровой беспородной собаки берут 100-150 см 3 крови, добавляют трилон - Б (2 мгсм 3),центрифугируют 3-5 - кратно при 3000 об./мин, с отмыванием изотоническим раствором натрия хлорида. Полученные эритроциты лизируют путем добавления пяти объемов дистиллированной воды,3-5 - кратным попеременным замораживанием и оттаиванием, с последующей обработкой ультразвуком при 22 КГц в течение 30 минут. Строму эритроцитов выделяют путем ультрацентрифугирования эритролизата в рефрижераторной центрифуге при 12000 об., и отмывают от гемоглобина. Строму эмульгируют в таком количестве физиологического раствора, чтобы 1 см 3 эмульсии содержал строму из 1 см 3 эритроцитов, и которую используют в качестве нормального антигена. Б. Техника получения пироплазменного антигена Из вены собаки - пироплазмоносителя, пораженной, берут 20 см 3 крови, добавляют к ней 40 мг трилона-Б (2 мг/см 3) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированной пироплазмозом собаке. На 20-30 день этому животному удаляют селезенку для усиления паразитемии. После операции и до тотального обескровливания, животному, с целью снижения влияния анемии, скармливают препарат железа сульфат (200-300 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены анаплазмами (обычно на 20-30 день), животное тотально обескровливают, обрабатывают кровь трилоном - Б (2 мгсм 3). Эритроциты отмывают физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости. Один объем отмытых эритроцитов смешивают с пятью объемами стерильной, нейтральной дистиллированной воды. Смесь выдерживают 2 часа при 4 С, 22022 затем фильтруют через стерильный двойной марлевый фильтр и центрифугируют при 7000 об., в течение 30 минут. Полученные осадки соединяют в один флакон с бусами, тщательно встряхивают и отмывают дистиллированной водой при повторном центрифугировании до полного просветления надосадочной жидкости 6 раз. После последнего центрифугирования осадок собирают во флакон с бусами, разводят стерильным физиологическим раствором (рН 7,0-7,2), в половинном объеме от количества отмытой паразитарной массы,подвергают обработке ультразвуком при 22 КГц в течение 30 минут, и эмульгируют в таком количестве физиологического раствора, чтобы 1 см 3 эмульсии содержал 1 см 3 гомогената. В. Техника получения антисыворотки Полученный паразитарный пироплазменный антиген используют для иммунизации собак,кроликов или морских свинок. За 15-20 дней до иммунизации, у собак, кроликов или морских свинок берут кровь для получения нормальной сыворотки. Собранную сыворотку объединяют и хранят при - 20 С для последующего приготовления изотипических и аллотипических иммуносорбентов и очистки с их помощью антиидиотипических антител. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют по следующей схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую,содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3,7-й день - внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут- 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций,осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после реиммунизации,контролируют титр преципитирующих антител в реакции количественной преципитации (РКП) или посредством иммуноферментного анализа (ИФА). По достижении титра антител не ниже 1,0 мг/ см 3 в РКП или 125000 в ИФА у кроликов берут по 40-50 см 3 крови, трехкратно, с интервалом 72 часа, а морских свинок обескровливают тотально. Г. Техника получения гамма-глобулина Способ 1. Из полученной антисыворотки сначала удаляют антитела к строме эритроцитов с помощью иммуносорбента из нормального антигена, затем из истощенной сыворотки путем высаливания 50 ным сульфатом аммония выделяют гаммаглобулиновую фракцию по общепринятой методике. Выделенный гамма-глобулин растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливают на колонке с сефадексом -50 или диализом против проточной воды (12 ч.),дистиллированной воды (24 ч.) и физиологического раствора (24 ч.). Обессоленный гамма-глобулин концентрируют в диализных трубках против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 600) до содержания белка не менее 1,0 мгмл и хранят при - 20 С или лиофильно высушивают. Способ 2. Из полученной антисыворотки сначала удаляют антитела к строме эритроцитов с помощью иммуносорбента из нормального антигена. Глобулиновую фракцию выделяют спиртовым методом из антисыворотки, используя раствор 53 ного этанола. Сыворотка должна иметь РН 7,0-7,1 и это достигается добавлением 2 М ацетатного буфера РН 4,65. Предназначенный для осаждения спирт охлаждают до минус 15-20 С, сыворотку-до 0 С. Фракционирование проводят при температуре минус 5 С, отделение осадка глобулина - в рефрижераторной центрифуге при той же температуре. Осадок растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливают на колонке с сефадексом -50 или диализом против проточной воды (12 ч.), дистиллированной воды (24 ч.) и физиологического раствора (24 ч.). Обессоленный гамма-глобулин концентрируют в диализных трубках против полиэтиленгликоля (ПЭГ - 600) до содержания белка не менее 1,0 мгмл и хранят при 20 С или лиофильно высушивают. Д. Техника получения препарата для диагностики пироплазмоза Полученный гамма-глобулин или очищенные на иммуносорбенте антитела (АТ-1) смешивают с ПАФ в соотношении 11 (содержание в 1 см 3 1 мг гаммаглобулина или 200 мг антител). Этой смесью иммунизируют кроликов. Полученный гамма-глобулин или очищенные на иммуносорбенте антитела (АТ-1) смешивают с ПАФ в соотношении 11 (содержание в 1 см 3 1 мг гаммаглобулина или 200 мг антител). Этой смесью иммунизируют кроликов, иммунизируют в 1-й день- антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую. На 7-й день иммунизируют антителами внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенную иммунизацию кроликов антителами по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. На 7-9 день после реиммунизации, при титре антител не менее 600 мкг/см 3, определенным иммуносорбционным методом, РКП или 18000 в ИФА, у кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 см 3,трехкратно, с интервалом 72 часа, и отделяли сыворотку. Из полученной сыворотки иммуносорбционным методом (путем включения в гранулы полиакриламидного геля взятых до иммунизации пироплазменным антигеном нормальной сыворотки или гамма-глобулинов собак или кроликов, которых использовали для получения АТ-1) получили очищенные антитела второго порядка (АТ-2) или 3 22022 антиидиотипы. Степень очистки контролируют спектрофотометрически, исследуя промывные воды после десорбции с иммуносорбентов промывных вод, содержащих антиизотипы и антиаллотипы. При показании спектрофотометра 0,01-0,02 сыворотка считается очищенной. Далее путем высаливания 50 -ным сульфатом аммония выделили гамма-глобулиновую фракцию,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мгсм 3. Полученную серию препарата расфасовывали в ампулы по 2 см 3 с содержанием белка 10 мгсм 3,подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. 2. Пример получения препарата для диагностики пироплазмоза крупного рогатого скота. В способе по примеру 1 в качестве животногореципиента пораженных эритроцитов используют крупный рогатый скот (корову, бычка) пироплазмоносителя ( ), а в качестве животного-донора пироплазменного антигена - здорового бычка или корову. В качестве животного-донора антисыворотки - кроликов. В качестве животного-донора для получения диагностикума - кроликов. 3. Пример получения препарата для диагностики пироплазмоза лошадей. В способе по примеру 1 в качестве животногореципиента пораженных эритроцитов используют лошадей (кобылу, жеребца) - пироплазмоносителя( ), а в качестве животного-донора пироплазменного антигена - здорового жеребца или кобылу. В качестве животного-донора антисыворотки - кроликов. В качестве животного-донора для получения диагностикума - кроликов. Полученный препарат испытывали на активность в РКП и ИФА, и использовали для определения пироплазменных антител. Первоначальные исследования проводили в сравнительным аспекте,со стандартным пироплазменным антигеном, изучая сыворотки естественно заразившихся и экспериментально зараженных пироплазмозом животных. В результате была установлена высокая диагностическая активность полученного препарата Исследования, проведенные на поголовье, более чем 120 животных, позволили установить высокую активность препарата для диагностики пироплазмоза, позволяющего диагностировать заболевание на ранних стадиях, и оказать своевременную лечебно-профилактическую помощь. В результате отмечалось повышение упитанности животных,снижение падежа, экономия затрат на лечение. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза, включающий заражение животныхпродуцентов пироплазмозом, с последующим отделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что паразитарным пироплазменным антигеном осуществляют иммунизацию продуцентов, получают антисыворотку, выделяют антипироплазменные антитела, иммунизируют ими других животных-продуцентов,получают антиидиотипическую сыворотку и методом иммуносорбции выделяют антиидиотипические антитела, при этом в качестве паразитарного антигена используют ультразвуковой лизат пироплазм, иммунизацию продуцентов осуществляют по схеме 1-й день - антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап, по 0,25 см 3 в каждую, 7-й день внутримышечно по 0,5 см 3 в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенно, иммуносорбцию осуществляют в полиакриламидном геле, выделение гамма-глобулиновой фракции осуществляют путем высаливания 50-ным сульфатом аммония,которую концентрировали в диализных трубках на ПЭГ-600 до содержания белка 10 мг/см 3.

МПК / Метки

МПК: A61K 39/00, A61K 39/395

Метки: пироплазмоза, способ, диагностики, препарата, получения

Код ссылки

<a href="https://kz.patents.su/4-ip22022-sposob-polucheniya-preparata-dlya-diagnostiki-piroplazmoza.html" rel="bookmark" title="База патентов Казахстана">Способ получения препарата для диагностики пироплазмоза</a>

Похожие патенты