Способ получения антипироплазменной сыворотки

(51) 61 39/00 (2006.01) А 61 К 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую,содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3,7-й день - внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день - внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка,через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Способ получения иммунной сыворотки,применяемой при серологической диагностике пироплазмоза, обеспечивает (по сравнению с известными способами) получение высокоактивных и высокоспецифичных сывороток с меньшими затратами и большим выходом препарата, что позволяет повысить достоверность серологических реакций.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Есполов Тлектес Исабаевич Кожаев Аскар Нурсултанович Раимханов Дархан Турдабекович(56) Фримель Г. Метод получения диагностической сыворотки, 1987(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИПИРОПЛАЗМЕННОЙ СЫВОРОТКИ(57) Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения иммунной сыворотки,применяемой при серологической диагностике пироплазмоза. Способ получения диагностической сыворотки предусматривает иммунизацию животных по следующей схеме 1-й день - антигеном в смеси с 22021 Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, в частности, к способу получения иммунной сыворотки,применяемой при серологической диагностике пироплазмоза. Известен способ получения антипироплазменной сыворотки (метод., 1976), заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов антигеном в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), при этом антиген вводят в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую,содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3. Через 21 день проводят внутримышечную инъекцию в 2 точки смеси антигена с ПАФ в той же дозе. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции. Известный способ не обеспечивает достаточного накопления антител, при этом титр антител сохраняется непродолжительное время. Известен способ получения диагностической сыворотки (метод А.М.Сафронова с соавт., 1976),заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов в 1-й день путем внутривенного введения антигена сначала 0,002 мг белка, через 30 минут 0,02 мг, и еще через 30 минут - 2 мг. Через 7 дней также 3 внутривенные инъекции в дозах 0,002 мг 0,02 мг, и 20 мг. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции. Известный способ также не обеспечивает достаточного накопления антител. Известен способ получения диагностической сыворотки (метод Г. Фримеля, 1987), заключающийся в сочетании внутримышечных и внутривенных инъекций антигена 1-й день - внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 2-й день внутривенно 5 мг белка 3-й день - внутривенно 5 мг белка. Забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции. Известный способ не обеспечивает достаточного накопления антител, а титр антител сохраняется непродолжительное время. Задачей изобретения является разработка эффективного способа получения антипироплазменной сыворотки. Задача решается тем, что осуществляют сочетанное введение антигена в подушечки лапок,внутримышечно и внутривенно. Технический результат, обеспечиваемый изобретением выражается в повышении специфической активности получаемых сывороток, пролонгацию выработки антител, удлинение срока эксплуатации животных-продуцентов, снижение себестоимости продукта. Цель достигается тем,что животных иммунизируют по следующей схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3, 7-й день - внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут -0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 2 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови,трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Пример получение антипироплазменной сыворотки А. Техника получения инвазированных эритроцитов. 1. Из вены собаки-пироплазмоносителя () берут 20 см 3 крови, добавляют к ней 40 мг трилона-Б (2 мг/мл) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированной пироплазмозом беспородной собаке. На 20-30 день этому животному удаляют селезенку для усиления паразитемии. После операции и до тотального обескровливания,животному, с целью снижения влияния анемии,скармливают препарат железа сульфат (200-300 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены пироплазмами (обычно на 2030 день), животное тотально обескровливают. 2. Из вены коровы (бычка)пироплазмоносителя ( ) берут 100 см 3 крови, добавляют к ней 40 мг трилона-Б (2 мг/мл) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированному пироплазмозом бычку (возраст 6-12 мес.). На 20-30 день этому животному удаляют селезенку для усиления паразитемии. После операции и до тотального обескровливания,животному, с целью снижения влияния анемии,скармливают препарат железа сульфат (300-500 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены пироплазмами (обычно на 20-30 день), животное тотально обескровливают. 3. Из вены жеребца (кобылы) - пироплазмоносителя ( ) берут 100 см 3 крови,добавляют к ней 40 мг трилона-Б (2 мг/мл) и вводят ее внутримышечно в область крупа неинвазированному пироплазмозом жеребенку (возраст 1218 мес.). На 20-30 день этому животному удаляют селезенку для усиления паразитемии. После операции и до тотального обескровливания,животному, с целью снижения влияния анемии,скармливают препарат железа сульфат (300-500 мг в сутки). На высоте паразитемии, когда 80-90 эритроцитов поражены пироплазмами (обычно на 20-30 день), животное тотально обескровливают. Б. Техника получения антигена из пироплазмид. Полученную кровь обрабатывают трилоном - Б(2 мг/ см 3). Эритроциты отмывают физиологическим раствором (рН 7,0-7,2) при 5000 об., в течение 15 минут, 3-5 кратно, до полного осветления надосадочной жидкости. Один объем отмытых эритроцитов смешивают с пятью объемами стерильной, нейтральной дистиллированной воды. Смесь выдерживают 2 часа при 4 С, затем фильтруют через стерильный двойной марлевый фильтр и центрифугируют при 7000 об., в течение 30 минут. Полученные осадки соединяют в один флакон с бусами, тщательно встряхивают и отмывают дистиллированной водой при повторном центрифугировании, затем подвергают заморажи 22021 достижении титра антител не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см 3 крови, трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. Если титры антител ниже указанных, то также проводят дополнительную внутривенную иммунизацию животных по схеме через 21 день. При достижении титра антител после второго цикла иммунизации не ниже 300 мкг/см 3 в РКП у кроликов берут по 40-50 см 3 крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, затем делают перерыв до следующего цикла иммунизации. В силу того, что предлагаемый способ предполагает многократное использование животных-продуцентов, с использованием феномена ревакцинации,специфическая активность получаемых сывороток значительно повышается, что повышает эффективность и результативность диагностических тестов. Полученные сыворотки апробированы на чувствительность и специфичность в реакции количественной преципитации (РКП), в сравнении с сыворотками полученными известными ранее способами. Результаты испытаний представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, предлагаемый способ в сравнении с известными позволяет получать диагностические сыворотки с более высокой специфической активностью и позволяет использовать животных продуцентов более длительное время, что снижает себестоимость сывороток. Таким образом, способ получения иммунной сыворотки, применяемой при серологической диагностике пироплазмоза, обеспечивает (по сравнению с известными способами) получение высокоактивных и высокоспецифичных сывороток с меньшими затратами и большим выходом препарата, что позволяет повысить достоверность серологических реакций. Таблица 1 Результаты испытаний активности и специфичности сывороток полученных по предлагаемому способу, в сравнении с известными Способ Среднее количество Результаты серологических реакций в реакции иммунизации дней количественной преципитации (средний титр эксплуатации сывороток), мкг/мл Предлагаемый 93 340 Метод. 31 260 Метод Сафронова 35 140 с соавт. Метод Г. Фримеля 32 280 ванию-оттаиванию, и 3-кратному центрифугированию-отмыванию до полного просветления надосадочной жидкости. После последнего центрифугирования осадок собирают во флакон,разводят стерильным физиологическим раствором(рН 7,0-7,2), в половинном объеме от количества отмытой паразитарной массы, и в течение 30 минут подвергают обработке ультразвуком при 22 КГц. Полученный дезинтеграт используют в качестве антигена для иммунизации продуцентов. Антиген контролируют на стерильность, используя специальные питательные среды (отсутствие бактериального загрязнения и грибковой микрофлоры указывает на чистоту препарата). Активность антигена проверяют титрацией в РНГА и ИФА. В. Техника иммунизации животных-продуцентов. Подготовленных для иммунизации кроликов(массой не менее 2,5 кг) иммунизируют пироплазменным антигеном по следующей схеме 11-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/ см 3, 7-й день -внутримышечно по 20 мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг. Через 21 день данную манипуляцию повторяют. Забор крови начинают с 3 го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови, трехкратно, с интервалом 72 часа. Повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации,по той же схеме. Далее цикл иммунизации и крововзятия повторяют. Начиная с 3-го дня после начала иммунизации,контролируют титр преципитирующих антител в реакции количественной преципитации (РКП). При мг белка в 2 точки ягодичных мышц 14-й день внутривенную иммунизацию кроликов по схеме сначала 0,02 мг белка, через 30 минут - 0,2 мг, и еще через 30 минут - 20 мг, через 21 день данную манипуляцию пов-торяют, забор крови начинают с 3-го дня после последней инъекции 1-го блока иммунизаций, осуществляют по 40-50 мл крови,трехкратно, с интервалом 72 часа, повторно кровь берут начиная с 3-го дня после внутривенной иммунизации, по той же схеме. Способ получения антипироплазменной сыворот-ки, включающий иммунизацию животных антиген-ным материалом, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что животных иммунизируют по следующей схеме 1-й день антигеном в смеси с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап кроликов, по 0,25 см 3 в каждую, содержание белка должно быть не менее 5 мг/см 3, 7-й день - внутримышечно по 20 Верстка Молдахметова Д.А. Корректор Мадеева П.А.