Способ получения антигена для диагностики эхинококкоза

(51) 61 39/00 (2010.01) 61 35/56 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Сущность изобретения состоит в том, способ получения антигена для диагностики эхинококкоза,включает отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином с использованием шуттель-аппарата,обработку гидролизата ультразвуком,центрифугированием,с последующим отделением центрифугата,смешиванием центрифугата с обработанной ультразвуком пузырной жидкостью 11, осаждения антигена спиртом,ресуспендирования в дистиллированной воде и лиофильного высушивания, причем смесь центрифугата и пузырной жидкости дополнительно смешивают с обработанным пепсином и ультразвуком гомогенатом герминативной оболочкой эхинококковых цист в соотношении 111. Предложенная методика получения антигена для серологической диагностики эхинококкоза позволяет более чем в 2 раза повысить выход антигена, в среднем на 20 процентов повысить его активность и на 4-5 повысить его специфичность.(72) Шабдарбаева Гульнар Сабыровна Тулемисова Жанара Кенесовна Ибажанова Асем Сериковна Турганбаева Гульнар Елдесбаевна Балгимбаева Айжан Ильясовна Каташева Жанат Чамаевна Хусаинов Дамир Микдатович(73) Республиканское государственное казенное предприятие Казахский национальный аграрный университет Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Предварительный патент РК 14288, кл. А 61 31/42, 2004(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭХИНОКОККОЗА(57) Изобретение относится к ветеринарной гельминтологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления антигена для диагностики эхинококкоза. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода антигена и его активности и специфичности. 23844 Изобретение относится к ветеринарной гельминтологии, иммунологии и биотехнологии, в частности к способу изготовления антигена для диагностики эхинококкоза. Известен, принятый за аналог, способ получения антигена для диагностики эхинококкоза путем отбора эхинококковых цист, выделения сколексов,их гидролиза пепсином, центрифугирования, с последующим отделением центрифугата, осаждения антигена спиртом,ресуспендирования в дистиллированной воде и лиофильного высушивания (Иммунологическая диагностика в профилактике эхинококкоза животных и человека в Казахстане (рекомендации). Алма-Ата, Кайнар,1980, . 18.). К недостаткам известного способа относится малый выход антигена, и его низкая активность и специфичность антигена. Известен, принятый за прототип, способ получения антигена для диагностики эхинококкоза путем отбора эхинококковых цист, выделения сколексов, их гидролиза пепсином с использованием шуттель-аппарата,обработке гидролизата ультразвуком,центрифугированием,с последующим отделением центрифугата,смешиванием центрифугата с обработанной ультразвуком пузырной жидкостью 11, осаждения антигена спиртом,ресуспендирования в дистиллированной воде и лиофильного высушивания(Предварительный патент РК 14288 Способ получения антигена для серологической диагностики эхинококкоза. бюл.5.-2004. кл. А 61 31/42). К недостаткам известного способа также относится малый выход антигена, и его низкая активность и специфичность антигена. Задачей изобретения является увеличение выхода антигена и повышение его активности и специфичности. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении выхода антигена и его активности и специфичности. Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения антигена для диагностики эхинококкоза, включающем отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином с использованием шуттельаппарата, обработку гидролизата ультразвуком,центрифугирование, с последующим отделением центрифугата,смешивание центрифугата с обработанной ультразвуком пузырной жидкостью 11,осаждение антигена спиртом,ресуспендирование в дистиллированной воде и лиофильное высушивание, смесь центрифугата и пузырной жидкости дополнительно смешивают с обработанным пепсином и ультразвуком гомогенатом герминативной оболочкой эхинококковых цист в соотношении 111. Заявленный способ отличается от прототипа тем,что дополнительно осуществляют отбор герминативной оболочки эхинококковых цист, их гомогенизацию,гидролиз и озвучивание. Установлены режимы гомогенизации, гидролиза и центрифугирования герминативного антигена. Кроме того, полученный после озвучивания фильтрат гидролизата герминативной оболочки дополнительно смешивают с озвученными сколексами и пузырной жидкостью. Таким образом,заявляемый способ соответствует критерию изобретения новизна. Известное техническое решение, в котором применялась смесь подвергнутых гидролизу пепсином и воздействию ультразвука сколексов с озвученной пузырной жидкостью, подвергнутых осаждению спиртом не обеспечивает достаточного увеличение выхода антигена, что достигается в заявляемом техническом решении. Кроме того,добавление озвученного гидролизата гомогената герминативной оболочки эхинококковых цист усиливает активность антигена. Это позволяет сделать вывод о соответствии критерию существенные отличия. Дополнительное использование герминативной оболочки эхинококковых цист позволяет достичь более высокого выхода антигенной массы. Гидролиз пепсином в кинетической среде с использованием шуттель-аппарата позволяет достичь более высокого выхода специфичных белковых фракций герминативного антигена. Ультразвуковой дезинтеграцией достигается разрушение сложных белковых конгломероатов, что способствует выходу компонентов с различными антигенными свойствами. Герминативный антиген содержит дополнительные белки, повышающие выход и активность антигена. Пример получения антигена для диагностики эхинококкоза Антигена для диагностики эхинококкоза получают следующим образом. Из пораженных ларвальным эхинококкозом органов животных (овец, свиней или крупного рогатого скота) отбирают эхинококковые цисты. Цисты, изолированные от тканей хозяина,вскрываются, жидкая часть сливается в кювету,получается пузырная жидкость. Далее внутреннюю часть цист соскабливают бранашами пинцета и сколексы вымывают в кювет с помощью 0,9 стерильного раствора натрия хлорида до соотношения 15 - получается суспензия сколексов. У отмытых оболочек цист отделяется внутренняя герминативная оболочка - полоучаются кусочки герминативной оболочки. Оставшаяся часть эхинококковый цисты уничтожается. Кусочки герминативной оболочки подвергают гомогенизации при 5 тыс. об/мин, в течение 3-5 минут и ресуспендируются в 0,9 стерильном растворе натрия хлорида в соотношении 15. На каждый литр приготовленной суспензии герминативной оболочки добавляют 25-30 мл 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 мл толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и 2 23844 температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1-нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 25-30 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученная жидкость, содержащая сколексы представляет собой суспензию. На каждый литр суспензии сколексов добавляют 25-30 мл 1 нормального раствора химически чистой соляной кислоты, 3-5 г пепсина и 10 мл толуола, смесь тщательно взбалтывают и доводят рН до 3,0 (1 нормальным раствором соляной кислоты). Полученная смесь сливается в шуттель-аппарат и помещается в термостат, где выдерживается при непрерывном помешивании шуттель-аппаратом и температуре 38-39 С в течение 48-72 часов. Через 1,3, 6, 12, 18 и 24 часа проверяется рН среды и доводится до 3,0 (1-нормальным раствором соляной кислоты). Через 48-72 часа с поверхности гидролизатной жидкости ватным тампоном снимается толуоловая пленка, жидкость при этом взбалтывать нельзя. Далее гидролизат подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Затем гидролизат центрифугируется при 3-5 тыс. оборотов 5-10 минут. Осадок суспендируется в 200 мл дистиллированной воды, подвергается повторной обработке ультразвуком до получения гомогенной суспензии (при 15-20 КГц в течение 2530 минут). Ультразвуковой лизат фильтруется через ватно-марлевый тампон (осадок удаляется). Пузырная жидкость подвергается обработке ультразвуком при 15-20 КГц в течение 25-30 минут. Ультразвуковой лизат фильтруется через ватномарлевый тампон (осадок удаляется). Полученные фильтраты герминативной оболочки, сколексов и пузырной жидкости смешивается в соотношении 111. Из полученной смеси осаждается антиген путем добавления 4 объемов 96 спирта этилового (ректификата) при комнатной температуре. При этом рН среды доводится до 7-7,2 путем добавления 1-нормального раствора химически чистого едкого натрия (в начале 1 мл, затем по каплям), с целью получения лучшего осаждения антигена. Через 20-24 часа выдерживания при температуре 4-6 С, выпавший осадок (антиген) собирается центрифугированием при 3-5 тыс. оборотов в течение 10-15 минут. Надосадочный спирт сливается, а осадок (антиген) вначале с небольшим количеством дистиллированной воды (50 мл) тщательно растирается в сметанообразную массу, а затем переливается в цилиндр, куда добавляется 950 мл дистиллированной воды. Полученная взвесь при помешивании разливается во флаконы или ампулы, закрывается стерильными ватными тампонами и подвергается лиофильной сушке. Ампулы запаиваются, а флаконы закрываются стерильными пробками и обкатываются алюминиевыми колпачками. Возможность достижения положительного эффекта. В результате проведенных исследований установлено, что предложенная методика получения антигена для серологической диагностики эхинококкоза позволяет более чем в 2 раза повысить выход антигена. Данные об испытании антигена на активность приведены в таблице 1. Как видно из результатов таблицы,способ получения антиген по предложенной методике позволил в среднем на 20 повысить его активность. При последующем забое положительно реагирующих животных диагноз патологоанатомически был подтвержден в 98 случаях (93 у контрольных), у сомнительно реагирующих животных в 32 случаях (в 28 у контрольных), тогда как среди отрицательно реагирующих животных в неблагополучном хозяйстве диагноз на эхинококкоз при патологоанатомическом исследовании был поставлен в 3 случаях (в 8 у контрольных). Таким образом, способ получения антиген по предложенной методике позволил на 4-5 повысить его специфичность. Таблица 1 Результаты сравнительного исследования специфичности антигенов в РСК и РНГА у крупного рогатого скота и овец в производственных условиях Вид животного Положительно Сомнительно Положительно Сомнит ельно В благополучных по эхинококкозу хозяйствах Кр. р. скот В неблагополучных по эхинококкозу хозяйствах По известной 37 15 5 методике 56 17 7 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для диагностики эхинококкоза, включающий отбор эхинококковых цист, выделение сколексов, их гидролиз пепсином с использованием шуттель-аппарата,обработке гидролизата ультразвуком, центрифугированием, с последующим отделением центрифугата,смешиванием центрифугата с обработанной ультразвуком пузырной жидкостью 11, осаждения антигена спиртом,ресуспендирования в дистиллированной воде и лиофильного высушивания отличающийся тем, что смесь центрифугата и пузырной жидкости дополнительно смешивают с обработанным пепсином и ультразвуком гомогенатом герминативной оболочкой эхинококковых цист в соотношении 111.