Способ обнаружения антигенов Mycobacterium bovis в патологическом и биологическом материале методом иммунохроматографии

(51) 01 33/53 (2006.01) 01 33/531 (2006.01) 01 33/577 (2006.01) 61 39/40 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ представляет собой набор компонентов, состоящий из тест-полоски с адсорбированными реагентами. При нанесении биологической жидкости на подушку для образца, она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тест-полоски меченые специфические антитела,которые аффинно связываются с анализируемым веществом. В ИХА используется конъюгат (моноклональные антитела-коллоидное золото), нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы поликлональные антитела,специфические к антигенам возбудителя туберкулеза, а на контрольной линии - антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего антигены туберкулеза и попадании его на мембрану с конъюгатом, происходит связывание антигена с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя сэндвич АтАг-Ат-метка, избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста.(72) Боровиков Сергей Николаевич Булашев Айтбай Кабыкешович Куйбагаров Марат Амангельдыевич Акибеков Оркен Султанхамитович Жумалин Айбек Хасиетович Джангулова Асем Нуржановна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина В ПАТОЛОГИЧЕСКОМ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей изобретения является повышение эффективности и экспрессности обнаружения антигенов,которая решается за счет того, что ИХА-тест Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике туберкулеза сельскохозяйственных животных. Основным способом прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является аллергический. Для этой цели используется сухой,очищенный ППД-туберкулин для млекопитающих,эффективность которого не отвечает современным требованиям, т.к. в некоторых случаях особенно в благополучных хозяйствах у животных на ППДтуберкулин отмечаются парааллергические реакции. Развитие перекрестных реакций у здоровых животных на инъекцию туберкулина связано с сенсибилизацией организма атипичными микобактериями,имеющими много общих антигенных эпитопов с патогенными видами микобактерий. Частота ложноположительных реакций, по данным литературы, колеблется от 1 до 3 и выше, что затрудняет определение истинной эпизоотической ситуации по туберкулезу и приводит к неоправданной выбраковке здоровых животных Жумаш А.С., Тургенбаев К.А. Пути оздоровления хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота// Алматы,2005.-С.22-27.,Тургенбаев К.А. Диагностика туберкулеза животных // Алматы, 2001. -С. 5-12. Ни один из способов детекции микобактериальных антигенов в полной мере не отвечает требованиям в сложившейся эпизоотической ситуации по туберкулезу. Классические способы недостаточно чувствительны и длительны. ПЦР-анализ имеет очень высокую чувствительность, но нецелесообразен для массовых исследований, поскольку расходные материалы для проведения исследований очень дорогостоящи. В этой связи хорошо зарекомендовал себя иммуноферментный анализ, который отвечает практически всем требованиям Международного эпизоотического бюро , . В., . . ,. С. , В. . ,. . .-. 1990 .284758. К перечню его достоинств можно отнести высокую чувствительность, специфичность. Но к недостаткам способов ИФА можно отнести необходимость использования специального оборудования, обучение специалистов и невозможность проведения анализа в полевых условиях, что является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику. Известен способ для индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза с использованием специальной питательной среды. При этом в качестве основы питательной среды используют ферментативный гидролизат из плацентарно-эмбрионально-маточных тканей/ отходов производства мясокомбинатов / убитых коров и свиней Пат. РФ. 2086257, М.кл. А 61 К 39/04, опубл. 10.08.1997. Известен способ индикации микобактерий туберкулеза в воздушной среде который характеризуется тем, что пробу воздуха пропускают через электрическое поле, при этом бактерии заряжаются в зоне отрицательного 2 разряда и оседают на положительно заряженном электроде, изготовленном в виде сменного металлического поддона, покрытого жидкой питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, последние культивируют в течение 2 дней, концентрируют, супернатант удаляют, а полученный осадок ресуспендируют,далее микобактерии туберкулеза определяют молекулярно-генетическим методом (ПЦР). Способ позволяет определить микобактерии туберкулеза(МБТ) в воздухе в короткие сроки (3-5 дней) Пат. РФ. 2162709, М.кл. А 61 К 39/04, опубл. 10.02.2001. Наиболее близкой к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является способ выявления микобактериальных антигенов с помощью моноклональных антител, нанесенных на нитроцеллюлозные стрипы с последующим выявлением образовавшегося иммунного комплекса с помощью пероксидазного конъюгата (точечный вариант ИФА) Пат. РК. 24462, М.кл. 01 33/577, 01 33/569, опубл. 15.08.2011, бюл. 8. Однако следует отметить, что при этом способе выявления микобактерий необходимо наличие оборудования и результаты могут быть получены в течение 3-4 часов. Технической задачей изобретения является устранение отмеченных недостатков, повышение эффективности и экспрессности обнаружения антигенов, которая решается за счет того, что ИХА-тест представляет собой набор компонентов, состоящий из тест-полоски с адсорбированными реагентами. При нанесении биологической жидкости на подушку для образца,она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии. Вместе с ней движутся нанесенные на нижнюю часть тестполоски меченые специфические антитела, которые аффинно связываются с анализируемым веществом. В ИХА используется конъюгат (моноклональные антитела-коллоидное золото), нанесенный на мембрану для конъюгата. На тестовой линии иммобилизованы поликлональные антитела,специфические к антигенам возбудителя туберкулеза, а на контрольной линии - антивидовые антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца, содержащего антигены туберкулеза и попадании его на мембрану с конъюгатом, происходит связывание антигена с конъюгатом Ат-метка. Затем иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со специфическими антителами, образуя сэндвич АтАг-Ат-метка, избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске. В результате были определены следующие оптимальные режимы сборки ИХА-теста для обнаружения антигеновв патологическом и биологическом материале. Растворы конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота наносят в объеме 11 мкл на 1 см на стекловолокнистые мембраны и высушивают их в течение 15 часов при комнатной температуре. Проводят сборку мембран. Для начала отклеивают липкие ленты нитро-целлюлозной мембраны(10 ), на одну сторону наклеивают стекловолоконную крупнопористую мембрану для нанесения коллоидного конъюгата (5),поверх предобработанную мембрану под образец(7). На другую сторону НЦМ наклеивают адсорбирующую мембрану (-045) фирмы. После сборки мембран проводят нанесение двух линии. На аналитическую нитроцеллюлозную мембрану наносят раствор специфических поликлональных антител в ФБС с помощью программируемого автоматического диспенсерадля формирования аналитической зоны. Для формирования контрольной зоны иммунохроматографической системы на расстоянии 5 мм от аналитической зоны наносят раствор антивидовых антителс концентрацией 1 мг/мл. После нанесения растворов антител на мембраны, их высушивают при комнатной температуре (10-12 ч). Полученные из мембран, с нанесенными иммунореагентами и впитывающих мембран поликомпозитные листы, нарезают на тестполоски с помощью Программируемого аппарата для нарезки мембранных стрипов(, Индия). Полоски высушивают при температуре 37 С(относительная влажность 25-30) в течение 24 ч и хранят при комнатной температуре в герметично закрытой упаковке. Перед исследованием патологического материала с помощью ИХА-теста, проводили его обработку кусочек органа или лимфатического узла(2,0-3,0 г) измельчали ножницами и растирали в фарфоровой ступке со стерильным песком с соблюдением правил работы с инфицированным материалом. К растертому материалу добавляли четыре части(по объему) 1 формалинизированного физиологического раствора с 8,0-9,0. Подготовленный материал переносили в маркированные бактериологические пробирки и прогревали в кипящей водяной бане в течение 30 мин для инактивации возбудителя и разрушения его термолабильных антигенных веществ. Центрифугировали 20 мин при 2000 об/мин и надосадочную жидкость использовали в качестве исследуемых образцов. Образцы биологического материала (моча) исследовались в нативном виде. Получение препаративного количества моноклональных антител После двухкратного клонирования гибридные клетки наращивают в пластиковых матрацах объемом 25-50 мл в полной ростовой среде, в течение 3-4 дней в С 2-инкубаторе при 37 С. Клетки снимают с поверхности пластика пипетированием и центрифугируют при 1000 оборотах/мин. в течение 7 минут. Осадок клеток ресуспендируют в неполной ростовой среде и вводят 2106 клеток внутрибрюшинно мышам линии/, которым за 7-10 дней до введения гибридомы был инъецирован пристан-2, 6, 10, 14 тетраметилпентадекан в дозе по 0,5 мл на голову. После образования асцитной опухоли через 12-14 дней мышь забивают методом цервикальной дислокации. Затем тушку фиксируют на препаровальной доске и препарируют кожу вдоль белой линии живота. Асцитную жидкость собирают из брюшной полости с помощью шприца, затем асцитную жидкость отделяют от гибридных клеток центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Гибридные клетки ресуспендируют в неполной ростовой среде и после подсчета количества клеток вводят в брюшную полость мышам линии / для дальнейшего накопления антител. Асцитную жидкость используют для выделения из нее иммуноглобулинов. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости осуществляют методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем забуференного физиологического раствора (ЗФР) с рН-7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на 12 часов при 4 С. Образовавшийся преципитат осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ЗФР с рН-7,2 и диализуют против ЗФР в течение суток. Очищенные моноклональные антитела в виде асцитной жидкости хранят при -70 С без консерванта или при 4 С с добавлением консерванта (0,1 азида натрия). Изготовление конъюгата Специфические антитела (АТ) растворяют в 1 мл 5 мМ натрий боратном буфере 9.0 чтобы получить 2,5 мг/мл. Этот раствор добавляют по капле к 10 мл раствора КЗ ( 7.0 доводят с помощью 0.01 М 2 О 3). Перемешивают в течение 30 минут и добавляют 1 мл 5 раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 5 мМ . Через 5 минут центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 30 минут (4 С). Осадок повторно растворяют в буфере (1 БСА в 49 мМ 2 О 4),до 40 при 580 нм. Способ осуществляется следующим образом Вынимают тест из алюминиевой упаковки. С помощью пластиковой пипетки исследуемая проба в объеме 100 мкл (5-6 капель) наносится на подложку для образца. Экспозиция - 15 мин при комнатной температуре. Тест является положительным, если в зоне детекции в течение 15 минут появились цветные полосы. Диагностикум сконструирован таким образом, что едва видимое присутствие окрашенной полосы уже свидетельствует о превышении концентрации антигена над пороговым уровнем. Если в зонах захвата не содержится яркой цветной полосы, а контрольная зона показывает такую полосу, то результат теста является отрицательным. Если в контрольной зоне не появилось чткой цветной полосы, то результат теста считается некорректным и подлежит повторному анализу. При этом необходимо использовать новое тестовое устройство. Осуществление способа обнаружения антигенов М. приведен в следующем примере. Пример 1. Для исследования был отобран патологический материал от 10 голов крупного рогатого скота из сельских округов Карагандинской области, которые показали положительный результат на аллергическую реакцию. Из проб патологического материала (легкие, кусочки печени, срезы паховых и лимфатических узлов) были выделены образцы ДНК и исследованы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР анализа) и разработанного ИХАтеста. Для проведения анализа использовали ПЦР тест-систему МТБ-ком(Россия),который амплифицирует ДНК возбудителя туберкулеза М. и М Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Результаты исследования проб биоматериала на туберкулез р/ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В результате проведенных исследований методом ИФА были получены результаты, которые полностью были подтверждены в ПЦР - анализе. Кроме того,необходимо отметить,что разработанная тест-система обнаруживала только микобактерии бычьего вида, что объясняется строгой специфичностью моноклональных антител к антигенам бычьего вида, использованных для изготовления конъюгата. Большее количество проб,положительных в ПЦР, объясняется тем, что эта тест-система предназначена для выявления ДНК возбудителя туберкулеза без разделения на микобактерии человеческого и бычьего вида. Пример 2. Для сравнительного исследования ИХА-теста с другими методами, после убоя, был отобран патологический материал от 10 голов крупного рогатого скота из сельских округов Карагандинской области,которые показали положительный результат на аллергическую реакцию. Результаты представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2 в результате патологоанатомических исследований у 5 животных в легких и лимфатических узлах были обнаружены признаки поражения туберкулеза, а у 3 голов КРС в легких и печени были обнаружены признаки эхинококкоза. У остальных 2-х голов никаких признаков туберкулеза не были обнаружены. В результате бактериологического исследования только у 6 голов были выделены возбудители туберкулеза, из них 4 ., 1 М. и 1 М С помощью ИХА, который был разработан сотрудниками НИИ биотехнологии Казахского агротехнического университета, были исследованы пробы патологического материала из них пробы от 4-х животных (40) показали положительный результат на туберкулез, такой-же результат был получен в сэндвич варианте ИФА. А в ПЦР анализе в 4 (40) пробах был обнаружен ДНК возбудителя. и в 1 пробе ДНК возбудителя М Таким образом, ИХА-тест подтвердил свою эффективность при выявлении возбудителей туберкулеза, причем результаты были получены в течение 15 минут. Таблица 2 Сравнительные показатели различных методов определения возбудителя туберкулеза р/ Название хозяйства и индивидуальный номер животного г.Караганда (0700) г.Караганда (0606) Фермерское хозяйство ШОН (8101) ИХА Точечный тест ИФА лимфатических узлов грудной полости Без изменений Туберкулез бронхиальных лимфатических узлов и лимфатических узлов грудной полости Эхинококкоз легких и печени Эхинококкоз печени Гиперплазия лимфатических узлов Иммунохроматографический тест может быть весьма полезным для проведения массовых обследований патологического и биологического материала в целях ранней диагностики туберкулеза,наносящего огромный экономический ущерб промышленному птицеводству. Тест может найти применение в ветеринарии как официальный метод при исследованиях проб патологического и биологического материала с целью экспрессдиагностики такой опасной для здоровья животных и человека болезни как туберкулез. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ обнаружения антигеновв патологическом и биологическом материале методом иммунохроматографии,включающий адсорбцию на мембране моноклональных антител,отличающийся тем, что в качестве агентов детекции антигенов используют моноклональные антитела, меченые коллоидным золотом.