Способ определения антител к возбудителю mycobacterium bovis на основе иммунохроматографического анализа

(51) 01 33/577 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый способом, является разработка ускоренного способа диагностики туберкулеза животных на основе иммунохроматографического анализа с использованием антител из. Способ определения антител к возбудителю на основе иммунохроматографического анализа, включающий иммунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки,получение раствора коллоидного золота для окраски специфических туберкулезных антигенов,нанесения иммунологических реагентов на тестполоски, контактирование тестируемой пробой,иницирование движение фронта жидкости в доль мембраны, сопровождающиеся специфическими воздействиями и окрашиванием аналитической тестполоски, в качестве основного иммунореагента для детекции возбудителя туберкулеза используют высокоспецифичные антитела против.(72) Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Тамгабаева Салиха Сарсенова Гульжаухар Талгатовна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЮНА ОСНОВЕ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА(57) Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных и представляет собой способ определения антител кв сыворотке, в плазме или в крови животных,основанный на проведении иммунохроматографического анализа. Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и иммунологии, в частности при диагностике туберкулеза животных и представляет собой способ определения антител кв сыворотке, в плазме или в крови животных,основанный на проведении иммунохроматографического анализа. Известен способ определения антител к возбудителюна основе иммунохроматографического анализа, включающий имунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки,получение раствора коллоидного золота для окраски специфических туберкулезных антигенов,нанесения иммунологических реагентов на тестполоски, контактирование тестируемой пробой,иницирование движение фронта жидкости вдоль мембраны сопровождающиеся специфическими воздействиями и окрашиванием аналитической тестполоски Патент Российской Федерации 2395092,кл. 01 33/53 (2006.01), 2010. Однако существенным недостатком данного способа является связывание маркера со всеми иммуноглобулинами и присутствующими в пробе плазмы крови. Задачей изобретения является разработка экспресс - способа диагностики туберкулеза на основе иммунохроматографического анализа. Технический результат,обеспечиваемый способом, является разработка ускоренного способа диагностики туберкулеза животных на основе иммунохроматографического анализа с использованием антител из. Способ определения антител к возбудителю на основе иммунохроматографического анализа, включающий имунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки,получение раствора коллоидного золота для окраски специфических туберкулезных антигенов,нанесения иммунологических реагентов на тестполоски, контактирование тестируемой пробой,иницирование движение фронта жидкости вдоль мембраны, сопровождающиеся специфическими воздействиями и окрашиванием аналитической тестполоски, в качестве основного иммунореагента для детекции возбудителя туберкулеза используют высокоспецифичные антитела против. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Предварительно получают антиген для иммунизации, который представляет собой стерильную серо-белого цвета инактивированную взвесьв дистиллированной воде. Культуру микобактерий, выращенную на поверхности жидкой питательной среде Сотона в течение 45 сут., обезвреживают стерилизацией в течение 90 мин при 1 атм., бактериальную массу отделяют фильтрованием. Готовит взвесь микобактерий в 40 см 3 дистиллированной воды в концентрации 60 мг/мл, помещают в специальный 2 сосуд с принудительным водяным охлаждением и разрушают в поле ультразвуковых волн при чистоте колебаний 22 кГц и экспозиции 10 мин на аппарате УЗДН-А. Полученную суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 8 000 об/мин, осадок отделяют. Концентрацию белка в надосадочной жидкости доводит до 1 мг/см 3. Выделенные антигены используют для иммунизации кроликов с целью получения гипериммунных сывороток. Иммунизацию кроликов проводит с применением неполного адъюванта Фрейнда. После завершения циклов иммунизации будет проведен оценка активности и специфичности полученных из крови подопытных животных гипериммунных сывороток путем постановки РП на агаровом геле. По предлагаемому способу введения антигена активность полученной сыворотки в РП составляет 164. Пример 2. Получение раствора коллоидного золота для окраски специфических туберкулезных антигенов. Получены конъюгации частиц коллоидного золота к белковому субстрату. Реакция проводился путем кипячения в течение 7 мин 0.01 золото хлористоводородной кислоты с 1 раствором цитрата натрия. Конъюгаты коллоидного золота с белками (и иными биоспецифическими зондами) становится все более перспективными маркерами в иммунохимических и молекулярно-генетических исследованиях биологических объектов с использованием методов световой и электронной микроскопии. Для осаждения гамма-глобулина, 36,6 г сульфат аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воде на магнитной мешалке. После берется 5 мл гипериммунной сыворотки и добавляют 2,5 мл сульфат аммония и на 30 минут ставит магнитную мешалку. Полученный препарат содержит примеси бета- и альфа-глобулиновых фракции. Для получения более очищенного гамма- глобулина, без примесейдругих белков проводит трех-разовое переосаждение. После третьего осаждения растворяют в физиологическом растворе, взятом в объеме, равном 1/10 исходного объема сыворотки. Пробу еще раз пропускают через колонки РД-10 и сефакрил -400. В результате будет получены очищенные препараты иммуноглобулинов. Высоленную сыворотку кролика 7,5 мл используют для приготовления конъюгата. Для синтеза конъюгированных с коллоидным золотом поликлональных антител к исследуемому антигену, используют коллоидное золота диаметром 20 . Для получения конъюгата коллоидного золота с антителами, специфичными к, коллоидного золота доводит до 8,5 с помощью 1 раствора карбоната калия (К 2 СО 3). Берется 200 мкл очищенных антител, в концентрации 1 мг/мл(АТ) по каплям добавляют к 98 мл коллоидного золота до концентрации 20 мкл/мл. Оставляют на 10 минут для полного растворения. Блокируют добавлением в 1 мл 1-го бычьего сывороточного альбумин (БСА) на 30 минут. Центрифугируют 1200 об/мин в течение 30 минут. Супернатант сливают, осадок ресуспензируют. Полученные конъюгаты коллоидного золота с белками должен быть стабильны, молекулы белков сохраняют биологические свойства. Концентрацию конъюгата проверяют по методу Брэдфорд. Для этого в лунки 96 луночного планшета вносят по 50 мкл -1 к. В 1 лунку ряда вносят 50 мкл (0,05 мл) исследуемого образца и титруют на 2 ряда. В первую лунку третьего ряда вносят 50 мкл 1 БСА и также титрую на 2 ряда. Во все лунки вносят по 50 мкл реактива Брэдфорд(коричневый цвет) и подчитывают концентрацию белка. В результате реакции устанавливают, что 1 мл коньюгата содержит 10 мг белка. Пример 3. Анализируемые образцы сыворотки крови и иммунохроматографическая тест-полоска при проведении анализа должны быть выдержаны при комнатной температуре (18-25 С). В чистую сухую емкость вносят анализируемую пробу сыворотки крови. Вскрывают упаковку,разрывая ее вдоль прорези, извлекают тест-полоску и помещают ее в емкость с пробой. При использовании тест-полосок, помещенных в планшет, пробу наносят в круглое окно планшета. Возможно использование как цельной, так и разведенной в несколько раз сыворотки (для полосок, помещенных в планшет - посредством последовательного нанесения пробы сыворотки и буфера). Результат анализа оценивают через 15-20 мин Выявление в тестовой зоне двух параллельных линий розового цвета (фиг.1, полоска 1) свидетельствует о положительном результате анализа, т.е. о наличии в образце специфических антител к возбудителю туберкулеза (фиг.1). Из фиг.1 видно, что несвязавшийся конъюгат взаимодействовали с реагентом в контрольной зоне тестового устройства, образуя окрашенную полосу и указывало на правильное проведение теста,выявление в тестовой зоне одной верхней линии розового цвета, свидетельствует об отрицательном результате анализа. Пример 4. Сравнительное испытание предлагаемого экспресс-способа для диагностики туберкулеза животных иммунохроматографического анализа (ИХА) - проводят путем тестирования 10 положительных и 10 отрицательных сывороток крови крупного рогатого скота по результатам иммуноферментного анализа (ИФА), (таблица 1). В таблице 1 установлено, полное совпадение(100) результатов тестирование испытуемых сывороток в ИФА и ИХА. Использование способа определения антител к возбудителюна основе иммунохроматографического анализа позволит получить высокочувствительные специфичные стандартные препараты для выявления сенсибилизации организма животных микобактериями туберкулеза. Таким образом,результаты апробации разработанного метода ИХА на основе антигенасвидетельствует о возможности экспресс - обнаружения противотуберкулезных антител с высокой чувствительностью и специфичностью, что значительно повышает эффективность диагностики туберкулеза животных. Таблица 1 Результаты сравнительное тестирования сывороток крови крупного рогатого скота методами ИФА и ИХА Способ определения антител к возбудителю на основе иммунохроматографического анализа, включающий имунизацию кроликов антигеном, с последующим забором у них крови и отделением сыворотки,получение раствора коллоидного золота для окраски специфических туберкулезных антигенов, ИХА нанесения иммунологических реагентов на тестполоски, контактирование тестируемой пробой,иницирование движения фронта жидкости вдоль мембраны, сопровождающиеся специфическими воздействиями и окрашиванием аналитической тестполоски, отличающийся тем, что в качестве основного иммунореагента для детекции возбудителя туберкулеза используют